Применение биосенсоров

 

Область применения ферментных электродов широка: медицинские и биологические исследования, сельское хозяйство и ветеринария, экология, пищевая промышленность и другие. Среди определяемых с помощью ферментных электродов веществ - лекарственные препараты и их метаболиты, пестициды, тяжелые металлы, биогенные амины и другие жизненно важные биологически активные вещества.

Перечень ферментов, используемых в настоящее время в ферментных электродах, не так уж мал, хотя по сравнению с общим числом известных ферментов составляет небольшую долю процента. В таблице приведены примеры ферментов, применяемых в потенциометрических сенсорах, а также область их применения и определяемые с помощью указанных ферментных электродов вещества. Более подробный список ферментных электродов можно найти в работе [44].

Некоторые из перечисленных в табл. ферментных электродов выпускаются для продажи. Так, фирма Owens - Illinois (Kimble) создала прибор для определения мочевины на основе иммобилизованной уреазы и аммиачного газочувствительного электрода. По приобретенному патенту фирма Technicon продает этот прибор в Европе [19]. Непосредственно ферментные электроды для определения мочевины, креатинина, аминокислот, спиртов, глюкозы и некоторых других веществ изготовляет по специальному запросу фирма Universal  Sensors (New Orlean, USA). У нас в стране ферментные электроды для оценки общей токсичности воды и определения фосфорорганических пестицидов и других веществ антихолинэстеразного действия изготовляются по предварительным заказам на экологическом факультете Казанского государственного университета. 

С помощью некоторых ферментных электродов можно определять индивидуальные вещества в сложных по составу смесях. Например, ферментный электрод на основе каталазы дает отклик только на перекись водорода - специфический субстрат этого фермента. Определение мочевины с помощью ферментного электрода на основе уреазы также можно осуществлять в присутствии многих других веществ. Даже ингибиторы уреазы в случае их присутствия в пробе не могут  помешать определению мочевины, если для градуировки электорода используется метод двойной стандартной добавки [15]. Другие ферментные электроды чувствительны к целым классам соединений. Например, ферментный электрод на основе оксидазы L-аминокислот или D-аминокислот дают отклик  на большинство L- или D-аминокислот соответственно. Ферментный электрод на основе митохондриальной моноаминоксидазы чувствителен к многим первичным, вторичным или даже третичным моноаминам.

Избирательность действия является одной из самых важных характеристик ферментного электрода. Хотя избирательность обусловливается уже самой природой фермента, дальнейшее ее увеличение, а главное - возможность направленного изменения в зависимости от конкретных аналитических задач, не перестает быть актуальной темой исследователей биосенсоров [95]. Основными факторами, позволяющими изменять в  заданном направлении избирательность биосенсоров, кроме природы биоспецифического препарата, являются способ  его получения и очистки, способ иммобилизации, выбор потенциометрического датчика, состава реакционной смеси, обработка фермента специфическими эффекторами  и другие. Роль перечисленных факторов  в создании ферментных электродов с  заданной  избирательностью показана в ряде работ [например, 96-99]. В работе [64] для повышения избирательности ферментного электрода на основе митохондриальной моноаминоксидазы  использовали действие специфических ингибиторов (профлавина, ацеклидина и других) , способных исключить активные центры этого фермента, катализирующие окислительное дезаминирование некоторых аминов. Последовательная обработка ферментсодержащей мембраны набором таких ингибиторов в соответствующих концентрациях позволила добиться повышения избирательности этого ферментного сенсора к отдельным моноаминам и, таким образом, осуществить определение индивидуальных моноаминов в смеси с другими. 

Практически не меньшее значение имеют ферментные электроды чувствительные к сумме различных веществ, обычно ингибиторов какого-либо фермента. Такие сенсоры могут быть использованы как тесты на группы определенных веществ. Особенно нужны тестовые приборы для экологии. Замена биотеста общей или какой-то отдельной токсичности ферментным электродом значительно ускоряет и облегчает определение уровня загрязнения. Перспективны в этом отношении являются ферменты, чувствительные к действию приоритетных загрязнителей объектов окружающей среды, например, холинэстеразы [100, 101]. Действительно, известно огромное число ингибиторов, влияющих на активность холинэстераз: фосфорорганические соединения и карбамиаты, эфиры сульфониевых кислот, соли четвертичных аммониевых оснований, акридины и их производные, соли металлов и другие. Созданные на основе холинэстераз сенсоры, таким образом, при соответствующих условиях дают отклик на сумму присутствующих в воде или воздухе экотоксинов антихолинэстеразного действия. Такой сенсор должен функционировать в потоке, в непрерывном режиме.

Первый анализатор такого типа для оценки качества воды САМ (Continuos Aqueous Monitor) был выпущен в 70х годах в США [76-79]. Иммобилизованную в кремневом геле или геле оксида алюминия холинэстнразу в виде таблетки на полиурутане помещали в реактор между двумя платиновыми электродами. Через реактор с помощью перестальтического насоса пркачивали анализируемую пробу воды или воздуха и раствор субстрата бутирилтиохолина. Цикл измерений занимал три минуты, включая  прокачку образца (2 минуты) и прокачку субстрата (1 минута) с  измерением разности потенциалов между электродами. Система САМ позволяла фиксировать в воздухе или  воде 0.1 мг параоксона, 0.2 мг дихлофоса, 1.2 мг диазинона, до 70 мг малатиона, 20 мг севина и другие яды. В проточном режиме в отсутствие ингибитора  реактор функционировал сутки. После действия необратимого ингибитора таблетка с иммоблизованным ферментом заменяется автоматически.

В системе автоматизированного контроля качества вод, разработанной во Франции [102,103] , был использован ферментный электрод на основе ацетилхолинэстеразы, описанный в работах [33, 41]. Прибор способен автономно фиксировать до десяти показателей качества воды: содержание кислорода, рН, мутность и прочие. Одним из показателей является измерение степени ингибирования ацетилхолинэстеразы.  Сенсор позволяет определять 0.003 мг этилпараоксона, 0.005 мг метилпараоксона, 0.004 мг малатиона, 0.014 мг этилпаратиона и метилпаратиона и другие антихолинэстеразного действия вещества. Измерениям не мешает минерализация вод на уровне не более 0.1 моль/л хлорида калия. Предусмотрена реактивация ацетилхолинэстеразы после действия необратимых ингибиторов растворами оксимов. Фирма Compagnie Generale des Eaux (Франция) использует этот сенсор также для качественного контроля водопроводной воды в Париже.

Оба ферментных сенсора (США и Франция) определяют по сути дела антихолинэстеразное действие токсичных примесей, содержащихся в воде и воздухе. В работе [104] этот показатель, полученный с помощью ферментного сенсора на основе иммобилизованной бутирилхолинэстеразы, сравнивали с данными биотеста токсичности вод (замедление флуорисценции микроводорослей) и получили удовлетворительную корреляцию обоих показателей. Эти результаты позволили рекомендовать разработанный сенсор для первичной оценки токсичности вод [105]. Таким образом, определение общей антихолинэстеразной токсичности многокомпонтных систем является перспективным тестом в экологическом мониторинге.

Более подробные сведения о ферментных электродах можно найти в обзорных работах [например, 8, 19, 33, 94, 106-110] и монографиях [например, 111, 112], а теорию их действия в работах [113-118].

В изложенном выше материале речь шла в основном о функционировании ферментных электродов в стационарном состоянии. В работе Кара [110] анализируется зависимость электродной функции ферментных электродов от времени. Эта работа говорит о перспективности в некоторых случаях использовать для измерений неравновесные условия.  Модель функционирования ферментного электрода в неравновесных условиях описана  работе [119]. Авторы работы подтвердили представленные теоретические положения экспериментальными результатами  для отклика холинэстеразного электрода в зависимости от времени. Экспериментальных исследований, в которых определение субстратов или ингибиторов ферментными электродами проводят в неравновесных условиях, выполнено сравнительно мало. Практически в этом случае измеряют либо изменение потенциала от фиксированного значения через заданный промежуток времени, либо сам промежуток времени, необходимый для изменения потенциала на определенную величину в заданном диапазоне. Последний прием используется чаще всего в ферментных реакторах, где фермент одлен от индикаторного электрода [29, 75], а также в специфических ферментных сенсорах, где индикаторным электродом служит электрод с газовым зазором [13, 38, 39, 47]. Изменение потенциала за определенный промежуток времени как способ работы с ферментными электродами используется еще реже. Таким способом, например, с помощью ферментного электрода с иммобилизованной на его поверхности бутирилхолинэстеразой определяли концентрацию лекарственного препарата такрина - обратимого ингибитора холинэстеразы. В этом случае фиксировали изменение потенциала от заданного начального значения за 20 секунд в присутствии ингибитора и субстрата (бутирилхолина) или только субстрата. На основании измерений строили градуировочную зависимость в координатах 'изменение потенциала (за 20 секунд) - логарифм концентрации ингибитора'. Достигнутый таким способом предел обнаружения такрина 5.10-10 моль/л оказался на порядок ниже, чем полученный с тем же ферментным электродом при работе в стационарных условиях [68]. Кроме снижения пределов обнаружения определяемых веществ, такой способ позволяет получить значительный выигрыш во времени проведения анализа.

Другие биосенсоры. В основе действия многих биосенсоров, на поверхности индикаторных электродов которых иммобилизованы целые клетки микроорганизмов или ткани, лежит действие ферментов, присутствующих в этих биоматериалах. Впервые такие биосенсоры были описаны в работах [120, 121]. Они обладают известными достоинствами, среди которых немаловажным является их относительная дешевизна, т.к. нет необходимости получать очищенные препараты ферментов. Кроме того, целые клетки могут содержать несколько ферментов и кофакторов, идущие с их участием реакции весьма разнообразны и многоплановы, что делает  применение  биосенсоров более универсальным.  Реактивация биослоя в сенсоре может быть осуществлена достаточно просто - погружением его в питательную среду. Основные  недостатки этих биосенсоров - медленный отклик электрода, связанный с необходимостью использовать толстые мембраны, а также сравнительно низкая селективность, обусловленная присутствием в клетке или тканях нескольких ферментных систем.

Гильбо [19, 94] приводит многочисленные примеры использования микроорганизмов для создания биосенсоров: Neigrospora europea - для оределения аммиака, Trichosporon brassicae - для определения уксусной кислоты, Sarcina flava - для определения глутамина, Azotobacter vinelaudit  - для определения нитратов и другие. В работах Речница и соавторов [122-128] описано несколько тканевых электродов, в которых использованы срезы почек и печени свиньи [126], срезы желтой тыквы [128], банана и другие. На основе гриба  Aspargilus niger  группой японских ученых были созданы биосенсоры для определения биогенных аминов в мясных продуктах [22].

В иммуноферментных электродах обычно фермент-метка пришивается к антигену или антителу, и электрод дает отклик на результат ферментативной реакции, на который в свою очередь весьма избирательно влияют продукты иммунной реакции [16].

В иммуноэлектродах возможно и непосредственное определение антител. Для этого иногда используют метод потенциометрического контроля реакции антитело - антиген, заключающийся в добавлении к серосодержащим белкам избытка нитрата серебра и определении непрореагировавших ионов серебра сульфидсеребряным электродам [129]. В другом случае непосредственно в полихлорвинильную мембрану вводят соединение ионофора и иммуногена, например, дибензо-18-краун-6 и динитрофенол. Электрод с такой мембраной обеспечивает избирательный отклик к антителу относительно иммуногена - динитрофенола [130, 131].

Оригинальный бактериальный электрод был предложен недавно в работах [132, 133] для определения бактерицидной активности и концентрации органических и неорганических веществ антимикробного действия. Микроорганизмы (E.coli и  Bacteris Subtilis) иммобилизовали в желатиновой или агаровой мембране, которую затем помещали на поверхности калиевого ионоселективного электрода. Приготовленный таким образом биосенсор перед началом работы уравновеншивали в стандартных условиях в растворах с определенной концентрацией хлорида калия и затем помещали в исследуемый раствор. В присутствии веществ бактерицидного действия, например, солей тяжелых металлов или органических антимикробных препаратов (этоний, катапол и другие) проницаемость мембраны микроорганизма по отношению к иону калия или даже целостность мембраны нарушались, что сопровождалось увеличением концентрации ионов калия у поверхности индикаторного электрода. отклик электрода в определенной области концентраций бактерицида находится в логарифмической зависимости от концентрации последнего. С помощью этого же сенсора можно было фиксировать и размножение микроорганизмов в мембране (регенерацию колонии) в питательном бульоне в присутствии хлорида калия.

Так называемые 'субстратные электроды' [134] представляют собой биосенсор, на поверхности которого в иммобилизованном состоянии находится субстрат, или ионоселективный электрод дает отклик на ионы субстрата [134,135]. Такие биосенсогры предназначены для определения активности фермента, а в некоторых случаях - концентрации ингибитора [70]. Широкого применения субстратные электроды не получили.

      

| Иммобилизация ферментов Кинетика ферментативной реакцииОпределение ингибиторов  |  Литература |