Определение ингибиторов

 

Как известно, ингибиторы различают по типу их взаимодействия с ферментом. Необратимые ингибиторы ковалентно связываются с активным центром фермента, связь обратимых ингибиторов менее прочная. Обычно для установления того, каким именно ингибитором является исследуемое вещество, реакционную смесь, содержащую все компоненты ферментативной реакции, подвергают диализу или проводят гельхроматографирование с целью отделить фермент от других компонентов. В результате этого сравнительно непрочная связь обратимого ингибитора с ферментом разрывается и активность фермента полностью восстанавливаетсяю Если взаимодействие фермента шло с необратимым ингибитором, то фермент-ингибиторный комплекс обычно не распадается и активность фермента не восстанавливается. Проявление ингибирующего действия на иммобилизованные ферменты существенно отличается от их действия в гомогенных системах. Для определения типа ингибирования в иммобилизованных ферментах нет необходимости проводить диализ или гельхроматографию: достаточно отмыть иммобилизованный фермент от избытка ингибитора и определить активность фермента до и после действия ингибитора. Для обратимого ингибитора активность фермента до и после действия ингибитора должна быть одинакова, для необратимого - активность фермента не восстанавливается, частичное восстановление активности иммобилизованного фермента говорит о том, что взаимодействие шло с комбинированным ингибитором [34], т.е. имело место обратимое и необраптимое ингибирование одновременно.

Действие необратимого ингибитора обычно возрастает с увеличением времени реагирования, поэтому оно может характеризоваться константой скорости взаимодействия фермента с ингибитором [35]:

(8)

где

- необратимый ингибитор

- фермент-ингибиторный сорбционный комплекс
- фермент-ингибиторный ковалентно связанный комплекс
- продукт, отщепляемый от
при образовании ковалентного фермент-ингибиторного комплекса
- продукт реактивации фермент- ингибиторного ковалентного комплекса
к1, к-1, к2, к3 - константы скоростей соответствующих стадий реакции

Обычно взаимодействие фермента с необратимым ингибитором характеризуют сложной бимолекулярной константой скорости кII, которая при времени протекания реакции  

 t равна

При [IН] >> [E]  бимолекулярная константа рассматривается как псевдомономолекулярная. Если 

 t и [IН] >> [E], значение кII может быть вычислено по уравнению:

  

 (9)

  

  где и

- начальные скорости ферментативной реакции в отсутствие ингибитора и после 

взаимодействия с ним фермента в течение t минут соответственно.

Отсюда концентрация необратимого ингибитора для данного времени взаимодействия t и постоянных условий проведения ферментативной реакции (рН, ионная сила и т.д.) может быть вычислена после измерения активности фермента до и после взаимодействия с необратимым ингибитором по уравнению:

 (10)

Если [IН] < [E], то процент ингибирования активности фермента после полного связывания молекул ингибитора с активным центром фермента прямолинейно зависит от концентрации ингибитора [36]. 

Практически эта зависимость справедлива только для высокоэффективных ингибиторов:

 (11)

где   b  - коэффициент пропорциональности.

Поскольку при [IН] >> [E]  взаимодействие фермента с необратимым ингибитором нарастает при увеличении времени взаимодействия, то предел обнаружения ингибитора в известных рамках может быть снижен увеличением времени t. Для случая [IН ] < [E], предел обнаружения зависит от концентрации активных центров фермента,  и может быть снижен при уменьшении [E0].

Обратимые ингибиторы по особенностям их влияния на скорость ферментативной реакции подразделяют на конкурентные, бесконкурентные, смешанные и неконкурентные. Взаимодействие обратимых ингибиторов можно представить схемой:

(12)

где  EI  - фермент-ингибиторный комплекс, ESI  - фермент-субстратный ингибиторный комлекс, Кi, aКi  - константы конкурентного и бесконкурентного ингибирования   соответственно, к1, к-1, к2, aк-1, bк2 - константы скоростей соответствующих стадий реакции.

Этой схеме соответствует уравнение скорости ферментативной реакции в присутствии обратимого ингибитора:

(13)

            Oбычно для ингибиторов a>1 и b<1, но при bR0, a может быть меньше 1. Для активаторов, действие которых описывается тем же уравнением, a<1, b>1. Если  aR ¥, ингибитор конкурирует за активный центр с субстратом  E + I  = EI, имеет место полное конкурентное торможение. Если aR0, конкурентное торможение практически отсутствует, ингибитор взаимодействует с фермент-субстратным комплексом, имеет место бесконкурентное торможение. Смешанный тип ингибирования характеризуется сочетанием конкурентного и бесконкурентного торможения, т.е. идет связывание ингибитора и с активным центром фермента, и с фермент-субстратным комплексом. Неконкурентное ингибирование является частным случаем смешанного торможения: a = 1,  b = 0. Каждый из этих процессов описывается уравнением, являющимся частным случаем вышеприведенного общего уравнения (13). Во всех случаях относительное изменение активности фермента в присутствии обратимого ингибитора при прочих равных условиях прямо пропорционально концентрации ингибитора. Для конкурентного ингибирования

(14)

Предел обнаружения конкурентного ингибитора зависит от [S]. При [S]<<Km

 

   

В этом случае  достигается минимальный для данной фермент-субстратной системы предел обнаружения (при прочих равных условиях).

Для бесконкурентного ингибитора

(15)

Предел обнаружения в этом случае не зависит от [S], если [S] >>Km.. При [S] > Km предел обнаружения [I] возрастает с уменьшением [S]. Таким образом, для определения коецентрации ингибитора бесконкурентного типа желательно использовать высокие [S].

Для смешанного ингибирования

(16)

Если a>1 (конкурентно-смешанный тип ингибирования), с уменьшением [S] предел обнаружения ингибитора снижается. При [S] << Km  достигается минимальный предел обнаружения, соответствующий 

Если a<1  (неконкурентно-смешанный тип ингибирования), предел обнаружения ингибитора снижается с увеличением [S] аналогично бесконкурентному ингибитору.

Для неконкурентного ингибирования (a=1)

(17)

 Предел обнаружения ингибитора в этом случае не зависит от [S], что обычно уменьшает погрешность определения ингибитора.

           Вышеприведенные зависимости лежат в основе определения обратимых ингибиторов с помощью ферментов.

В ферментных электродах с иммобилизованным ферментом ингибирование происходит в гетерогенной среде и характеризуется особенностями превращения субстратов и диффузионными ограничениями [33]. Изменение концентрации субстрата и насыщение субстратом иммобилизованного фермента отличаются от ферментного раствора в сторону больших концентраций субстрата. При иммобидизации также изменяются значения кинетических параметров ферментативной реакции и даже в некоторых случаях тип ингибирования [38].

Применение ферментных электродов в анализе естественно предполагает многократность их действия. Поэтому определение обратимых ингибиторов с помощью ферментных электродов имеет явные преимущества перед определением необратимых. Для обратимых ингибиторов многократность действия иммобилизованного фермента обусловливается легкостью восстановления ферментативной активности обычным промыванием электрода. Для необратимых ингибиторов в большинстве случаев для восстановления активности фермента необходимо использовать специальные реактиваторы.

Особенностью обратимых ингибиторов является то, что тип ингибирования ими зависит не только от природы фермента и ингибитора, но и от природы субстрата, используемого в реакции [39], а также состава реакционной среды [40]. Как следует из вышеизложенного, тип ингибирования играет существенную роль при подборе оптимальных условий проведения анализа. Поэтому перед началом определения ингибитора необходимо установить, какой тип ингибирования имеет место для выбранной фермент-субстратной системы и составе реакционной среды.

В работе [33] подробно рассматриваются особенности определения ингибиторов с помощью ферментных электродов. В том числе уделено внимание определению типа обратимого ингибитора для фермента, иммобилизованного на поверхности электрода. При конкурентном ингибировании максимальная скорость ферментативной реакции не изменяется, увеличивается только константа Михаэлиса. При бесконкурентном торможении величина Km и V меняется в одинаковое число раз. Неконкурентное торможение вызывает уменьшение V, но не изменяет значение Кm. В смешанном торможении происходит изменение величин V и Кm в разное число раз. 

Градуировочными характеристиками ферментного электрода для определения ингибиторов служит зависимость отклика электрода (% ингибирования) от логарифма концентрации ингибитора при фиксированной концентрации субстрата. Крутизна электродной характеристики электрода для определения ингибиторов обычно ниже, чем для субстратов.

Область концентраций ингибитора, вызывающая отклик ферментного электрода, зависит от концентрации фермента (его активности): чем меньше активность иммобилизованного фермента, тем ниже область концентраций ингибиторов, определяемых с его помощью. Таким образом, требования к ферментным электродам для определения ингибиторов существенно отличаются от требований, предъявляемых к ферментным электродам для определения субстратов. Концентрация связывающего агента и время контакта с ним иммобилизуемого фермента также существенны для выбора оптимальных условий приготовления ферментного электрода для определения ингибиторов. Увеличение концентрации связывающего агента и времени его контакта с ферментом ведет к денатурации последнего и соответственно к уменьшению его активности.

Зависимость диапазона измеряемых концентраций ингибитора от концентрации субстрата в ферментных электродах подчиняется тем же закономерностям, что и для неиммобилизованного фермента (см. выше). Но при этом надо учесть, что тип  ингибирования иммобилизованного фермента и неиммобилизованного одним и тем же ингибитором может быть разным. Так, в работе [38] показано, что многие конкурентные ингибиторы холинэстеразы при иммобилизации последней в желатине становятся неконкурентными.

Для определения ингибиторов также, как и субстратов необходимо установить оптимум рН и температуры реакционной смеси, которые обычно отличаются от таковых для неиммобилизованного фермента [например,20].

Время инкубации обратимого ингибитора с ферментом при достижении предварительно стационарного значения потенциала электрода не существенно. Время достижения стационарного значения потенциала электродом для ингибиторов выше, чем в электродах для субстратов. Его величина обычно составляет не менее 2-3 минут, но часто оно бывает  и больше.

Действие необратимых ингибиторов с иммобилизованным  ферментом,  так же, как и с неиммобилизованным, зависит от времени контакта фермента с инибитором в отсутствие субстрата. Субстрат, если он присутствует в реакционной среде в достаточной концентрации, может полностью прекратить взаимодействие необратимого ингибитора с ферментом. Даже при низких концентрациях субстрат значительно ослабляет действие ингибитора. Поэтому ферментный электрод предварительно выдерживают в растворе исследуемого необратимого ингибитора определенное время, затем в реакционную смесь добавляют субстрат в заданной концентрации и фиксируют значение стационарного потенциала. Отклик ферментного электрода увеличивается при увеличении времени инкубации фермента с необратимым ингибитором  для данной его концентрации. Градуировочной характеристикой ферментных электродов для определения необратимых ингибиторов является зависимость потенциала электрода от логарифма концентрации ингибитора при фиксированном (одном и том же) времени выдерживания электрода в растворе с ингибитором. Оптимальные уловия проведения определения необратимых ингибиторов нгесколько отличается от условий определения обратимых ингибиторов. При работе с ферментным электродом приходится выбирать рН и температуру, благоприятствующие взаимодействию ингибитора и фермента, и таковые, благоприпятствующие работе электрода с субстратом. Увеличение температуры ускоряет реакцию фермента с ингибитором, но может ввызвать инактивацию самого фермента за счет температурной денатурации. Что касается концентрации субстрата, то обычно ее выбирают достаточно большой.

Некоторые необратимые ингибиторы определяют также, как обратимые. Это возможно, если константа скорости распада фермент-ингибиторного ковалентно связанного комплекса (к3) достаточно высока. Примером таких необратимых ингибиторов могут быть карбамиаты, характеризующиеся высокой скоростью декарбамилирования активного центра холлинэстераз. Поэтому их определение в работах [33, 41] описывается как определение обратимых ингибиторов. В этом случае восстановление активности холинэстеразы происходит сравнительно легко при тщательном промывании электрода буферным раствором.

В отдельных случаях определение необратимых ингибиторов приходится вести в присутствии субстрата, например, если электрод работает в непрерывном режиме, в потоке [42]. В таких определениях концентрацию субстрата выбирают минимальной.

Для восстановления активности фермента и, соответственно, обеспечения многократности действия ферментного электрода после инактивации  необратимыми ингибиторами, обычно применяют реактиваторы, разрушающие фермент-ингибиторный ковалентный комплекс. Процесс реактивации характеризуется определенной скоростью, зависящей от природы фермента, ингибитора и реактиватора, а также от концентрации реактиватора и и температуры реакционной среды. Зависимость от природы реактиватора и фермент-ингибиторного комплекса выражается константой скорости реактивациию. Для иммибилизованных ферментов величина константы скорости реактивации для ряда исследованных ингибиторов холинэстеразы не отличается от таковой для неиммобилизованного фермента [43]. Тем неменее необходимость использовать реактиватор при определении ферментными электродами необратимых ингибиторов в достаточной степени усложняет и удлиняет процесс.

 

| Иммобилизация ферментов   | Кинетика ферментативной реакции | Применение биосенсоров  | Литература |