Кинетика ферментативной реакции

 

Реакция, протекающая в слое фермента, может быть представлена следующей схемой:

(1)

где Е  - фермент, S  - субстрат, ES - фермент-субстратный комплекс (комплекс Михаэлиса), Р - продукты реакции, к1, к-1 и  к2 - константы скорости соответствующих стадий реакции. Скорость ферментативной реакции  измеряется изменением концентрации субстрата  или продукта реакции за единицу времени:

(2a)

(2б)

При постоянной температуре зависимость начальной скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата описывается уравнением Михаэлиса - Ментен

(3)

   где

 - начальная скорость ферментативной реакции,

V

- максимальная скорость ферментативной реакции: 

- каталитическая активность активного центра фермента

[E0

- концентрация активных центров фермента.

[S]

- концентрация субстрата

Km

- константа Михаэлиса.

Km в первом приближении характеризует сродство субстрата к ферменту. При [S] << Km  - реакция первого порядка, при  [S] >> Km - нулевой порядок реакции.

В ферментном электроде скорость диффузии субстрата или продукта реакции через слой иммобилизованного фермента к поверхности индикаторного электрода описывается уравнением диффузии:

(4)

(5)

где   t  - время протекания реакции, DS - коэффициент диффузии субстрата, DР - коэффициент диффузии субстрата, х - толщина слоя фермента от точки измерения до поверхности ИСЭ.

При установлении стационарного значения потенциала:

(6)

(7)

Как следует из уравнений (6) и (7), концентрация продукта или субстрата у поверхности индикаторного электрода, а, следовательно, и его отклик зависит от нескольких параметров: 

активности фермента в ферментном слое

толщины слоя l
коэффициентов диффузии DS или DР
константы Михаэлиса и исходной концентрации субстрата Km и [S]

Предполагается, что коэффициент диффузии субстрата или продукта реакции постоянен во всем слое иммобилизованного фермента. Практически это не всегда выполняется и зависит от однороднрости слоя фермента, а также граничащих поверхностей ферментсодержащей мембраны.

Время отклика ферментного электрода зависит от отношения l2/DS . Cамым простым способом  снижения времени отклика является уменьшение толщины ферментного слоя l . Возможен и другой путь снижения времени отклика - увеличение коэффициента диффузии, что связано с механическими свойствами ферментсодержащего слоя. Уменьшение толщины иммобилизованного фермента также обусловлено механическими свойствами ферментсодержащей мембраны и обычно ограничивается 30 мкм [33]. Во всяком случае врремя отклика ферментного электрода обычно значительно выше, чем ИСЭ.

 

Определение субстратов. При прочих равных условиях скорость образования продукта или убыли субстрата в ферментативной реакции , т.е. изменение концентрации потенциалопределяющих ионов, завист  от концентрации субстрата. Для потенциометрических индикаторных электродов зависимость отклика электрода от концентрации субстрата логарифмическая, для амперометрических - линейная.

Если [S] << Km, скорость ферментативной реакции пропорциональна концентрации субстрата, т.е. предел обнаружения предел обнаружения  субстрата ферментеым электродом определяется пределом обнаружения соответствующих ионов ИСЭ. Если [S] >> Km,то скорость ферментативной реакции не зависит ни от концентрации  субстрата, ни от Кm: она равна максимальной скорости, и, следовательно, зависит только от активности фермента. Cтационарная концентрация продукта реакции на поверхности индикаторного электрода при одном и том же значении [S] зависит от некого фактора s

и увеличивается  с его ростом. По расчетам, приведенным в работе [33], увеличение фактора s  неравномерно изменяет концентрацию продукта реакции по отношению к концентрации субстрата. Так, при s = 0.5  [Р]  менее 0.1[S], при s = 2   [P] = 0.2[S], при s = 5    [P] = 0.5[S], при s = 10   [P] = 0.75[S].

Увеличение s  достигается увеличением активности фермента или толщиной ферментного слоя на поверхности ИСЭ. Однако, последнее нежелательно, т.к. при этом увеличивается время отклика ферментного электрода. При определении субстратов поэтому стараются увеличивать активность фермента при минимальной толщине ферментного слоя. При достаточной активности фермента весь субстрат за время диффузии его через иммобилизованный фермент может превратиться в продукты реакции. Эта активность для ферментного электрода является оптимальной. Дальнейшее увеличение активности фермента обычно снижает отклик электрода, т.к. субстрат и продукт реакции в этом случае не доходят до поверхности индикаторного электрода, и концентрация потенциалоопределяющих ионов в приэлектродном слое уменьшается.

 

| Иммобилизация ферментов  |  Определение ингибиторов  |  Применение биосенсоров |  

| Литература |