Как это начиналось...

Интерес к биосенсорам (Б) в Казанском университете как объектам исследования относится к периоду конца 70-х и начала 80-х годов. Тематика работ по Б была навеяна проблемами определения различных биологически активных веществ с сильно выраженными токсическими свойствами на случай риска их появления в окружающей среде. Среди специалистов – химиков, которые правильно оценили важность исследования и разработки Б для этих целей следует упомянуть проф.Ю.М.Каргина (физико-химик) и проф.В.Г.Винтера (биохимик). Именно в начале 80-х годов в ходе обсуждения с этими специалистами проблематики использования реагентов нового поколения со специфическими свойствами обозначились перспективы их практического применения. К этим реагентам относились ферменты или содержащие их биоматериалы, а также ДНК, которые можно было использовать для издания соответствующих систем контроля, в частности, различных ферментных датчиков, или биохимических сенсоров, как потом их стали называть.

На кафедре аналитической химии КГУ небольшая группа исследователей под руководством проф.Г.К.Будникова уже к середине 80-х годов разработала  ферментные электроды на основе иммобилизованной в нитроцеллюлозную пленку холинэстеразы и стационарного ртутного электрода с серебряной подложкой в качестве физического преобразователя. Эти электроды предназначались для определения концентрации тиохолиновых эфиров, хлорофоса и прозерина, ингибиторов и активаторов холинэстеразы. Устройства и способы определения были защищены авторскими свидетельствами.

Исследования по тематике Б в тот период, как и в последующие годы, проводили, как правило, с привлечением аспирантов и студентов-дипломников.

Основное  внимание уделялось оптимизации амперометрического отклика разработанных Б, оценке факторов, влияющих на сигнал, состава раствора, моделирующего возможный реальный объект  анализа. В тот же период была реализована идея использования денатурированной ДНК как модификатора в составе биохимической части устройства, что позволило продемонстрировать расширение аналитических возможностей холинэстеразного Б для определения различных антител на принципах иммуноферментного анализа (Г.К.Будников, Э.П.Медянцева, С.С.Бабкина).

В начале 90-х годов в тематике Б на кафедре аналитической химии существенных изменений не произошло. Исследования продолжались достаточно интенсивно в направлении улучшения аналитических характеристик  ферментных электродов на основе холинэстеразы, разработанных ранее, количественной оценки факторов, определяющих срок их службы, разработки ряда конкретных методик определения ингибиторов холинэстеразы (в основном, фосфорорганических соединений) в модельных и реальных системах , оценке констант связывания гетерогенного иммунокомплекса (например, иммуноглобулин G – вирус крапчатости гвоздики) и т.д. (Г.К.Будников, Э.П.Медянцева, Ли Фа-Шень).

Было показано, что на каталитическую активность иммобилизованной холинэстеразы активирующее действие в модельных системах оказывают ионы щелочноземельных металлов. Величины констант связывания иммунных комплексов для антител – 2,4-Д и 2,4,5-Т обеспечивают высокую чувствительность иммунохимического определения с использованием холинэстеразного Б, что было продемонстрировано в аспирантской работе М.Г.Вертлиб. К концу 1999 г. в рамках этой тематики была защищена еще одна кандидатская диссертация, в которой идеи иммунохимического анализа, проводимого с применением холинэстеразного Б, были перенесены на разработку новых способов определения антигенов Candida albicans и Phytophtora infectaus, а также некоторых гербицидов триазинового ряда (М.П.Кутырева).

Кроме холинэстеразы в составе биочувствительной части ферментного электрода использовали и другие ферменты, в частности, L-цистеин десульфогидролазу и моноаминоксидазу (аспирантская работа Н.В.Кремлевой). Б на основе и иммобилизованной холинэстеразы и стационарного ртутного электрода как нестандартного средства измерения (аспирантская работа О.В.Федосеевой) для использования в полевых условиях не подходили Требовались другие устройства на иных физических преобразователях.

Эта проблема, связанная с проведением эколого-аналитического мониторинга и контроля окружающей среды, решались в другой группе исследователей, которые располагались на кафедре прикладной экологии КГУ. С середины 90-х годов работы ведутся совместно. Полученные в последнее время результаты позволяют говорить о переходе от различных фрагментарных данных  к концепции конструирования Б, алгоритмам направленного изменения  чувствительности и селективности Б в отношении определяемых соединений - субстратов и эффекторов фермента.

С начала 90-х годов биосенсорная тематика параллельно начала развиваться на экологическом факультете Казанского государственного университета. Выбор тематики исследований был сделан под непосредственном влиянием зав. кафедрой аналитической химии КГУ проф.Г.К.Будникова и зав.кафедрой микробиологии КГУ проф.Е.Н.Офицерова, которые хорошо представляли перспективы данного научного направления в решении задач эколого-аналитического контроля.

Не дублируя работ, проводимых на кафедре аналитической химии, сотрудники экологического факультета КГУ (первоначально - к.х.н.Г.А.Евтюгин, к.х.н.Д.А.Семанов, инженеры Р.Р.Искандеров, Д.Ф. Ахметзянова и В.У.Смирнова) ориентировались в первую очередь на решение задач практического использования биосенсоров, апробацию создаваемых образцов в условиях реального мониторинга объектов окружающей среды. До середины 90-х годов основное внимание уделялось самым простым средствам измерения - стеклянным рН-метрическим электродам. На этапе становления большую помощь оказали постоянные консультации и поддержка д.х.н. Е.Б.Никольской, ст.н.с. Института эволюционной физиологии и биохимии им.И.М.Сеченова РАН (Санкт-Петербург). Она не только принимала сотрудников экологического факультета в Санкт-Петербурге, но и неоднократно выезжала в Казань для совместных исследований.  К сожалению, молодые сотрудники экологического факультета, начавшие научную карьеру в биосенсорике в то время (В.У.Смирнова, Д.Ф.Ахметзянова), по разным причинам покинули Казанский университет, не защитив диссертаций. Завершением начального этапа можно считать создание первых работоспособных холинэстеразных потенциометрических биосенсоров на основе бумажных мембран и первые масштабные полевые испытания биосенсоров, проведенные в Волго-Ахтубинской пойме (младший научный сотрудник, потом аспирант Р.Р.Искандеров, 1991-1992 гг.). К 1993-1994 гг. были сформулированы основные направления проводимых исследований, предопределившие развитие биосенсорики в последующий период времени: выявление факторов, определяющих чувствительность и селективность определения ингибиторов с помощью иммобилизованных ферментов; оптимизация способов пробоподготовки применительно к особенностям функционирования иммобилизованных ферментов и специфике матрицы объекта контроля; применение биосенсоров в тестировании общего уровня загрязнения.  В 1993 г. была защищена первая кандидатская диссертация Р.Р.Искандерова "Применение холинэстеразных биосенсоров в анализе объектов окружающей среды и контроле качества вод" (научные руководители проф. В.З.Латыпова и д.х.н.Е.Б.Никольская).  Начиная со второй половины 90-х годов 20 века,  в год публиковалось 4-5 статей, в том числе в международных рецензируемых журналах. Появляются накладные ферментсодержащие мембраны на основе коммерческих пластиковых носителей. Центр тяжести исследований переносится на установление влияния микроокружения фермента, условий его иммобилизации, способа детектирования ферментативной реакции на аналитические характеристики определения ингибиторов - загрязнителей окружающей среды. Помимо потенциометрических сенсоров развиваются различные варианты амперометрических и фотометрических Б, в том числе, для проточно-инжекционных условий измерения сигнала. Начинается процесс активной смены элементной базы Б -  благодаря стажировке в Техническом университете г.Будапешт (Венгрия) были начаты эксперименты с сурьмяными потенциометрическими электродами. Проф.Х.З.Брайнина (Уральский государственный экономический университет и НПВП "Ива", г.Екатеринбург) любезно предоставила для исследований первые образцы планарных эпоксиграфитовых и печатных графитовых электродов. Была продолжена апробация биосенсоров в реальных природоохранных проектах. Опытные образцы и технологии получения ферментсодержащих препаратов были переданы в Центральные специализированные инспекции аналитического контроля (ЦСИАК) Минприроды Татарстана и России, ГЕОХИ им.Вернадского РАН, научные учреждения Перми, Ростова-на-Дону, Казани. Более двух лет велись совместные исследования с сектором биотестирования ЦСИАК Минприроды РТ по оценке токсичности промышленных сточных вод. Были защищены кандидатские диссертации Е.П.Ризаевой ("Биохимическая диагностика загрязнения объектов окружающей среды", 03.00.16 - Экология, автореферат) и Е.Е.Стойковой ("Экспресс-определение загрязнителей окружающей среды с помощью ферментативных колориметрических тестов", 02.00.02 - Аналитическая химия). С 1995 года исследования получили поддержку федеральных программ (РФФИ, Минобразования). Началось международное сотрудничество с французскими исследователями (проф.Ж-Л.Марти, Перпиньянский университет). Как обобщение полученных результатов и научный итог - защита в 1999 г. докторской диссертации Г.А.Евтюгина (02.00.02 - Аналитическая химия). 

Защита докторской диссертации - всегда этап, предполагающий смену приоритетов и направления исследований. После 2000 основное внимание перешло от потенциометрических к амперометрическим сенсорам. Вместе с опытом практических исследований выросло понимание того, что биосенсорика обладает внутренней логикой развития независимо от природы биологического компонента и независимо от природы трансдьюсера. Свойства Б, его характеристики, специфика проявления биохимических процессов проявляются на тонкой, практически двумерной границе между преобразователем сигнала и биологическим компонентом. Любые пути совершенствования Б так или иначе приводят к необходимости изменений, технических и научных решений именно в рамках данного сверхтонкого слоя, составляющего существо биосенсорики.  Анализ основных мировых тенденций развития биосенорики подтвердил это во многом интуитивное умозаключение. Начиная с конца 20 века резко возросло число и удельный вес работ по Б, связанных с совершенствованием измерительной части - это появление и закрепление в практике новых способов модификации электродов, таких как использование электрополимеризованных покрытий, расширение перечня гетерогенных медиаторов электронного переноса, применение самосборки для получения высокоорганизованных поверхностных слоев, полимеры с молекулярными отпечатками. Эти подходы, ранее рассматривавшиеся почти исключительно в рамках традиционных задач электрохимии (топливные элементы, проблематика гомогенного переноса электрона, электрокатализ), не просто вошли в биосенсорику, а составляют суть, научную новизну большинства  публикаций в самых престижных журналах.

Освоение Terra Incognita началось с новых биологических компонентов. Холинэстеразы имели достаточно ограниченные возможности амперометрической регистрации аналитического сигнала. Соответствующие Б были достаточно подробно и плодотворно исследованы в рамках кандидатских диссертаций Э.В.Гоголь (совместная аспирантура Казанского и Перпиньянского университетов, научные руководители Г.А.Евтюгин и Ж.-Л.Марти) "Сравнительная характеристика амперометрических холинэстеразных сенсоров на основе углеродистых материалов для детектирования остаточных количеств пестицидов" (03.00.16 - экология) и А.Н.Иванова  "Электрохимические холинэстеразные сенсоры на основе модифицированных углеродных электродов" (02.00.02 - аналитическая химия, автореферат). В данных работах прошли обкатку идеи модификации электродов, впоследствии использованные для других биологических объектов: полианилин как способ генерации потенциометрического отклика, нафион как матрица для электростатической иммобилизации ферментов, гетерогенные и гомогенные медиаторы электронного переноса в амперометрических биосенсорах.

Первой "ласточкой" в освоении новых биологических объектов можно считать кандидатскую диссертацию Р.Р.Габсабировой "Амперометрические пероксидазные сенсоры на основе графитовых электродов для оценки загрязнения окружающей среды" (03.00.16 - экология). В данной работе были предложены не только новые решения в области создания амперометрических пероксидазных сенсоров, но и проведена сравнительная характеристика различных способов обобщенной оценки загрязнения окружающей среды легко окисляющимися органическими соединениями. В диссертации Е.В.Супрун "Пероксидазные и холинэстеразные сенсоры на основе модифицированных графитовых электродов" (02.00.02 - аналитическая химия, автореферат) предложены упрощенные способы определения остаточных количеств пестицидов в растительной продукции, позволившие исключить стадии удаления органических растворителей, инактивирующих фермент. Кроме того, разработаны биферментные сенсоры, в которых холинэстераза и пероксидаза иммобилизованы на едином носителе и позволяют проводить определение или пестицидов, или легко окисляющихся ароматических соединений, в зависимости от используемого формата измерения сигнала и состава сточных вод.

В диссертации О.Э.Гольдфарб "Электрохимический ДНК-сенсор с ферментативным усилением сигнала" (02.00.02 - аналитическая химия, автореферат) пероксидаза была использована уже в качестве индикаторного фермента для определения совершенно других биоаффинных взаимодействий - реакций ДНК с электрохимически активными интеркаляторами и лекарственными препаратами сульфаниламидного и фенотиазинового ряда. Предложен способ регистрации взаимодействий ДНК с низкомолекулярными соединениями, обладающий высокой чувствительностью и одновременно достаточной простотой аппаратурного оформления.

В настоящее время основным направлением научных исследований, проводимых в области биосенсорики в Казанском государственном университете, является развитие новых подходов к регистрации сигнала биораспознавания на основе электрополимеризованных покрытий. Разработаны новые оригинальные подходы позволяющие не только улучшить характеристики разнообразных Б на основе ферментов и нуклеиновых кислот, но и в значительнрой степени варьировать свойства трансдьюсера путем получения наноструктурированных пленко, обладающих свойствами направленного изменения электрохимических характеристик. Разработаны способы электрополимеризации анилина, тирамина, получения смешанных покрытий полианилина и полифенотиазинов, обладающие расширенным диапазоном рабочих потенциалов, устойчивостью в нейтральной и слабощелочной среде, высокоразвитой поверхностью и хорошо совместимые с биополимерами различной природы.

Исследования в области биосенсорики продолжаются и на других кафедрах университета - кафедре неорганической химии (проф.С.С.Бабкина), кафедре биохимии (ученики проф.В.Г.Винтера). Но это уже другая история...

 

Г.К.Будников

Зав.кафедрой аналитической химии, 

д.х.н., профессор

Г.А.Евтюгин,

Профессор кафедры аналитической химии,

д.х.н., профессор