5. ВЛИЯНИЕ ЭФФЕКТОРОВ НА ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕСТИЦИДОВ 

 

Многие компоненты, присутствующие в объектах окружающей среды (ионы металлов, фториды и др.) меняют активность нативной и иммобилизованной БуХЭ и ее чувствительность к действию необратимых ингибиторов.

Так, изученные ионы Cu(II), Pb, Cd, Hg(II) проявляют конкурентное обратимое ингибирующее действие на нативную БуХЭ с пределом обнаружения  n 10-5 M. Ионы Al в диапазоне концентраций 1 10-5 - 5 10-5 М незначительно усиливают активность БуХЭ, а при более высоких концентрациях - снижают. И ингибирующее, и активирующее действие ионов Al в отсутствие стабилизаторов фермента описываются единым градуировочным уравнением. Присутствие 0.008% N-фталилхитозана и полиглюкина повышает пределы обнаружения в 2-4 раза и снижает чувствительность определения эффекторов в 1.2-2 раза вследствие связывания ионов металлов в комплексы или смещения равновесия образования гидроксоформы МеОН+. При этом активирующее действие ионов алюминия полностью подавляется.

Необратимое ингибирующее действие пестицидов на нативную БуХЭ в присутствии обратимых эффекторов снижается в силу так называемого защитного эффекта. Влияние ионов металлов наиболее значительно в диапазоне рН, соответствующем максимуму накопления гидроксо-ионов МеОН+ (табл.11).

 Иммобилизация БуХЭ сопровождается увеличением пределов обнаружения ионов металлов, при этом максимальное значение степени ингибирования не превышает 60%. Возможно, это обусловлено совместным действием двух факторов - изменением рН и буферной емкости микроокружения фермента в мембране по сравнению с раствором и торможением переноса ионов металлов в мембрану. Исключение составляет определение ионов Cu(II) и Hg(II) с помощью потенциометрического биосенсора с мембраной из тринитрата целлюлозы с предварительным инкубированием в течение 10 мин.

Возможно, снижение пределов обнаружения ионов Cu(II) и Hg(II) в 100-1000 раз по сравнению результатами, полученными с нативным ферментом, обусловлено стерическим блокированием доступа субстрата к ферменту в результате образования нерастворимых фосфатов (рис.4).

При определении пестицидов с помощью биосенсоров защитное действие ионов металлов выражается в уменьшении степени ингибирования на 10-15% при сохранении угла наклона градуировочного графика пестицида. Добавление ПАВ полностью подавляет защитное действие эффекторов (рис.5). 

Присутствие органических растворителей, смешивающихся с водой (ацетон, этанол), снижает чувствительность определения пестицидов с помощью нативной БуХЭ (табл.12). Иммобилизация фермента повышает его устойчивость к органическим растворителям, так же, как и чувствительность к необратимым ингибиторам. Так, добавление 10-25% ацетона и этанола не смещает градуировочные кривые определения пестицидов. Исключение составляет CCl4. Его присутствие в концентрации до 8% снижает пределы обнаружения пестицида в 10 и более раз при сохранении или некотором уменьшении предела его обнаружения (рис.6). 

При наличии в структуре молекулы эффектора нескольких потенциальных центров связывания с ферментом проявление ингибирующих свойств на нативные и иммобилизованные ферменты осложняется. Так, гидразониевые соли диалкилдитиофосфатов А-3-А-8 не проявляют ингибирующего действия на БуХЭ. Соответствующие фосфиты показывают лишь незначительное обратимое ингибирующее действие. Это обусловлено взаимодействием гидразониевого (потенциальный центр обратимого ингибирования) и фосфатного (ответственного за необратимое ингибирование) фрагментов, препятствующим их взаимодействию с активным центром фермента. Электрохимическое окисление ингибиторов в присутствии хлорид-ионов уменьшает прочность связывания, в результате после обработки изученные соединения проявляют необратимое ингибирующее действие на нативную БуХЭ и обратимое - на иммобилизованную БуХЭ. Снижение рН раствора повышает подвижность гидразониевого иона, в результате чего ингибирующее действие усиливается. Использование микробиальной карбоксилэстеразы, активность которой достаточно велика в кислых средах, показало максимум необратимого ингибирующего действия соединений А-1 – А-8 при рН 3.5-4.0 (рис.7, а). Аналитические характеристики определения гидразониевых солей диалкилдитиофосфатов приведены в табл.13. Нативная БуХЭ в этих условиях ферментативной активности практически не проявляет. Однако иммобилизация БуХЭ на бумаге смещает максимум ингибирования к рН  7 (рис.7,б).

Добавление ПАВ, а также промывка мембраны после инкубирования с целью удаления гидразониевого иона повышают чувствительность определения соединений А-3 – А-8 в результате снятия защитного эффекта.

Подобным образом себя ведут a-аминофосфонаты Б-1 – Б-14. Взаимная ориентация амино- и фосфорильной групп и образование слабой внутримолекулярной водородной связи >NH...O=P< блокируют оба потенциальных центра взаимодействия с ферментом. После электрохимической обработки a-аминофосфонаты демонстрируют необратимое ингибирующее действие, причем так же, как и в случае гидразониевых солей, усиливающееся в кислой среде. Аналитические характеристики определения a-аминофосфонатов с помощью микробиальной карбоксилэстеразы приведены в табл.14. При замене трис-буферного раствора на фосфатный угол наклона градуировочного графика возрастает в 1.1-4.0 раза, причем наибольшие изменения наблюдаются для соединений с наиболее объемными заместителями у углеродных атомов, соседствующих с аминогруппой.

Фосфорилированные каликсарены Б-15-Б-19 проявляют ингибирующее действие только после электрохимической обработки (табл.15). Аналитические характеристики определения  каликсаренов с помощью нативной БуХЭ практически совпадают. Можно предположить, что в данном случае происходит стерическое блокирование доступа субстрата за счет образования комплекса типа "гость-хозяин" между каликсареном и аминокислотными остатками белка, примыкающими к активному центру.

Таким образом, проявление защитного действия эффекторов опосредуется ионными равновесиями, определяющими не только накопление гидроксоформ ионов металлов - обратимых ингибиторов БуХЭ, но и распределение эффекторов между раствором и ферментсодержащей мембраной. Для ингибиторов с несколькими центрами связывания необходимо также учитывать взаимное влияние потенциальных центров взаимодействия с ферментом (внутримолекулярный защитный эффект, взаимное связывание с образованием комплексов и т.д.). 

 

| Определение ингибиторов | В начало | Диагностика загрязнения |