4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНГИБИТОРОВ В МОДЕЛЬНЫХ ВОДНЫХ РАСТВОРАХ

 

Для определения фосфорорганических пестицидов второго поколения с применением БуХЭ требуется предварительное их превращение в кислородные аналоги. Для этого предложен эффективный способ окисления, основанный на электрохимическом генерировании окислителя при электролизе растворов бромидов или хлоридов щелочных металлов в присутствии пестицида. Образование брома или хлора in situ позволяет избежать разбавления пробы и повышает эффективность окисления по сравнению с традиционными способами. В результате такой пробоподготовки пределы обнаружения пестицидов снижаются в 1000-10000 раз. В табл.6, табл.7, табл.8 приведены аналитические характеристики определения пестицидов с помощью нативной и иммобилизованной БуХЭ после их электрохимического окисления. Для сравнения представлены данные, полученные с помощью микробиальной карбоксилэстеразы.

Сопоставление аналитических характеристик определения пестицидов с помощью БуХЭ и карбоксилэстеразы позволяет идентифицировать отдельные токсиканты. Так, чувствительность определения ДДВФ с помощью карбоксилэстеразы в 24 раза выше, нежели достигнутая с помощью БуХЭ. И наоборот, чувствительность определения карбофоса с помощью карбоксилэстеразы в 26 раз ниже, нежели при использовании БуХЭ.

При использовании биосенсоров наилучшие пределы обнаружения зафиксированы при использовании нитратцеллюлозных мембран. Влияние носителя фермента на диапазон определяемых концентраций и чувствительность определения ингибитора зависит от природы токсиканта.

Так, корал с наибольшей чувствительностью определяется на нейлоновых мембранах, ДДВФ - на нитратцеллюлозных, а чувствительность определения метафоса не зависит от носителя БуХЭ. Переход от накладных мембран к мембранам, формируемым непосредственно на поверхности сенсора, сопровождается сужением диапазона определяемых концентраций пестицидов.

Изменение предела обнаружения и чувствительности определения в ряду изученных пестицидов при использовании одного и того же носителя фермента в целом согласуется с изменением бимолекулярных констант ингибирования kII и аналитических характеристик определения с помощью нативного фермента (табл.6-8). 

Для расчета кинетических  параметров  ингибирования  предложено  использовать анаморфозу градуировочных графиков в  координатах:

 

где CI – концентрация ингибитора, а I – степень ингибирования фермента. Константа ингибирования рассчитывается из угла наклона линейного участка кривой при  I более 30% (табл.9). При последующем увеличении концентрации ингибитора снижение ферментативной активности частично компенсируется замедлением переноса продукта ферментативной реакции из мембраны в раствор.

Для изучения распределения пестицидов в мембране впервые предложено использовать составные мембраны, образованные двумя одинаковыми слоями, плотно прижатыми единым пакетом к поверхности электрода. Такая конструкция позволяет проводить измерение ингибирующего эффекта в каждом слое и для биосенсора в целом. Ингибиторы равномерно распределяются в мембране, о чем говорит постоянство ингибирования БуХЭ в каждом отдельном слое. В то же время снижение отклика биосенсора, включающего два таких слоя, при той же концентрации пестицида было почти в два раза ниже вследствие уменьшения насыщения мембраны субстратом. 

Низкие пределы обнаружения пестицидов и высокая чувствительность их определения с помощью биосенсоров с накладными мембранами объясняются сорбционным накоплением гидрофобных молекул пестицидов на материале мембраны. В подтверждение этого добавление неионогенных ПАВ Triton-X-100, Tween-20 и ПЭГ-10000 в концентрациях n 10-4% - n 10-2% повышает чувствительность определения и снижает пределы обнаружения пестицидов в 2-8 раз (табл.10).

Изменение наклона градуировочных графиков при добавлении ПАВ хорошо коррелирует с влиянием природы носителя БуХЭ на аналитические характеристики определения ингибиторов. Изменение чувствительности тем больше, чем значительнее разница соответствующих пределов обнаружения, достигаемых с помощью нативной и иммобилизованной БуХЭ в отсутствие ПАВ. Тем самым влияние носителя фермента нивелируется. Поверхностно-активные вещества, с одной стороны, подавляют неспецифическую сорбцию ингибитора, увеличивая его подвижность в мембране, а с другой - гидрофобизируют мембрану, увеличивая коэффициент распределения пестицида между полимерной мембраной и водой.

Напротив, ингибирующее действие обратимых ингибиторов в присутствии ПАВ подавляется. Как и в случае пестицидов, наибольшее влияние ПАВ наблюдается, когда гидрофильно-гидрофобные свойства носителя фермента и ингибитора максимально различаются (пестицид–бумажная мембрана, фториды–нитрат целлюлозы или нейлон). Наибольшее снижение ингибирования фторид-ионами наблюдается при концентрации ПАВ 2 10-4- 2 10-3 %. Для ионов металлов присутствие ПАВ увеличивает влияние рН на снижение отклика биосенсора (рис.2, определение Cu(II)). По-видимому, это обусловлено совместным влиянием двух факторов - изменением концентрации гидроксо-ионов МеOH+, определяющих ингибирующий эффект ионов металлов, и распределением ингибитора между мембраной и раствором.

Разнонаправленное влияние ПАВ на ингибирующее действие обратимых и необратимых ингибиторов дает дополнительную возможность прогнозируемого воздействия на селективность соответствующего биосенсора в отношении различных групп токсикантов. Что касается сверхтонких мембран, формируемых непосредственно на поверхности электрода путем кросс-сшивки фермента в альбумине или без носителя, в них влияние гетерогенных факторов минимально. Это является следствием отсутствия диффузионного торможения реагирования и низкой концентрации потенциальных центров неспецифической сорбции ингибитора. Как результат, рассчитанные константы ингибирования kII в пределах погрешности совпадают с полученными для нативного фермента и слабо меняются при добавлении ПАВ.

При переходе от стационарных условий, т.е. в объеме ячейки, к измерениям в потоке жидкости чувствительность определения пестицидов дополнительно увеличивается благодаря сорбционному накоплению ингибитора при высоком отношении площади электрода к объему ячейки (рис.3).

Таким образом, выбор носителя фермента, условий проведения инкубирования и измерения, добавки поверхностно-активных веществ, меняющих гидрофильно-гидрофобный баланс на поверхности мембраны, позволяют регулировать перенос реагентов через границу мембрана-раствор и тем самым существенно менять предел обнаружения и чувствительность определения пестицидов даже при использовании одного и того же фермента.

 

| Операционные характеристики | В начало | Влияние эффекторов |