2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

 

Использованы лиофилизированные препараты ацетилхолинэстеразы из эритроцитов крови человека (АО"Биомед", г.Пермь) с удельной активностью 1.2 Е/мг, бутирилхолинэстеразы (БуХЭ) из сыворотки крови лошади (АО"Биомед" и Sigma Chemical Co, США) с удельной активностью 4.2 и 600 Е/мг соответственно, микробиальной карбоксилэстеразы (АО"Биотехнология", г.Москва) с удельной активностью 1.3 Е/мг.

Ферменты иммобилизовали кросс-сшивкой глутаровым альдегидом на коммерческих нейлоновых (Hybond, Amersham, Англия) и нитратцеллюлозных (Sartorius, Германия) мембранах, кальке чертежной, в пленках желатина, альбумина и тринитрата целлюлозы, а также непосредственно на поверхности сенсора без носителя. Кроме того, ферменты стабилизировали путем включения в твердые растворы на основе N-фталилхитозана, полиглюкина и b-декстрана.

В качестве датчиков в составе биосенсоров использовали стеклянный плоский и сурьмяный рН-метрические электроды (потенциометрические биосенсоры), платиновый и эпоксидно-углеродные электроды (амперометрические биосенсоры). Характеристики ферментсодержащих мембран и потенциометрических биосенсоров на их основе приведены в табл.1. Субстратами ферментативных реакций служили эфиры холина и тиохолина, индофенилацетат и фенилацетат.

В качестве отклика биосенсоров измеряли максимальный сдвиг потенциала (потенциометрическое детектирование) или тока окисления при +0.68 В отн. Ag/AgCl (амперометрическое детектирование) после введения в ячейку субстрата. В проточно-инжекционных условиях измерения проводили с помощью блока БР-1 проточного анализатора (АО"Химавтоматика", Москва) с дозатором петлевого ввода пробы и проточной ячейкой типа "отражательная стенка". В экспериментах с нативными ферментами скорость реакции измеряли спектрофотометрически по времени достижения фиксированного изменения оптической плотности раствора (времени полуреакции).

Модельными токсикантами служили фосфорорганические инсектициды ДДВФ [О-(дихлорэтинил)-О,О-диметилфосфат], диазинон, метафос, карбофос, корал, параоксон, тетраэтилмонотиопирофосфат, фозалон, хлорофос (табл.2), соли тяжелых и токсичных металлов, гидразониевые соли диалкилдитиофосфатов (табл.3), <альфа>-аминофосфонаты и фосфорилированные каликс[4]арены (табл.4).

Ингибирующее действие выражали величиной относительного снижения отклика биосенсора (степень ингибирования I,%) или скорости ферментативной реакции в растворе после контакта фермента с ингибитором. Тионовые инсектициды перед определением окисляли до кислородных аналогов бромной водой или электрохимически в гальваностатическом электролизе в присутствии NaCl. Все измерения проводили в 2 10-3 М фосфатном или трис-буферном растворе, содержащем NaCl или Na2SO4 в широком диапазоне рН.

 

| Общая характеристика работы | В начало | Операционные характеристики биосенсоров  |