1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

 

В условиях растущего антропогенного пресса на окружающую природную среду происходит постоянное расширение числа загрязнителей, подлежащих контролю, ужесточение гигиенических нормативов их допустимого присутствия в воде, почве и продуктах питания. Усложнение химического анализа по числу контролируемых показателей и требованиям к минимально определяемым содержаниям токсикантов приводит к разрыву между потребностью в информации о загрязнении окружающей среды и своевременностью ее получения. Тестовые методы групповой диагностики заполняют важную промежуточную нишу между индикаторными и количественными методами анализа, полуколичественно оценивая содержание определенных групп токсикантов и потенциальную опасность загрязнения окружающей среды в целом.

Ферментативные методы анализа являются одним из наиболее перспективных направлений диагностики загрязнения окружающей среды. Помимо высокой чувствительности к ингибиторам ферментов - загрязнителям окружающей среды, использование ферментов имеет прямое экотоксикологическое обоснование и позволяет моделировать процессы токсикации организма на молекулярном уровне. Это дает основание считать развитие методов ферментативного контроля загрязнения окружающей среды  актуальным и перспективным научным направлением.

Практическое использование ферментных средств контроля состояния окружающей среды тормозится неадекватным развитием теоретических и методологических основ использования ферментов, особенно в составе специализированных измерительных устройств - биосенсоров. Крайне мало сведений о факторах, определяющих аналитические характеристики биосенсоров. Кроме того, практически отсутствуют алгоритмы направленного изменения чувствительности и селективности определения ингибиторов в зависимости от конкретной решаемой задачи. 

Это в полной мере относится к холинэстеразам. Этот фермент имеет уникально широкий круг ингибиторов, включающий такие приоритетные загрязнители, как фосфорорганические и карбаминатные пестициды, поверхностно-активные вещества, соли тяжелых и токсичных металлов. Однако из-за низкой селективности определения ингибиторов, обилия факторов, меняющих чувствительность отклика, измерению предшествует предварительное разделение и концентрирование пробы с помощью экстракции, тонкослойной или препаративной хроматографии. Это нивелирует основное преимущество ферментативных методов анализа - простоту и экспрессность. Не развит альтернативный подход к контролю объектов окружающей среды, состоящий в оценке антихолинэстеразной активности (токсичности) пробы в целом, без соотнесения сигнала с качественным и количественным составом загрязнителей, подобно методам биотестирования.

Целью настоящей работы явилось развитие теоретических и прикладных основ функционирования биосенсоров, предназначенных для группового определения ингибиторов холинэстераз и диагностики общей токсичности (загрязненности) объектов окружающей среды. 

Для достижения поставленной цели были решены следующие задачи:

- разработаны различные электрохимические биосенсоры на основе холинэстеразы, иммобилизованной на коммерческих мембранах и непосредственно на активной поверхности сенсора, позволяющие в широких пределах варьировать характеристики определения ингибиторов различного механизма действия; определены режимы функционирования биосенсоров и оптимальные условия определения ингибиторов – загрязнителей окружающей среды;

- созданы тест-устройства на основе стабилизированных препаратов бутирилхолинэстеразы и карбоксилэстеразы, включенных в водорастворимые пленки на основе стабилизаторов - N-фталилхитозана, полиглюкина, <бета>-декстрана, установлены рабочие условия их использования для определения остаточных количеств пестицидов в различных объектах окружающей среды;

- на основе сравнительных исследований иммобилизованной и нативной холинэстеразы выявлены факторы, определяющие чувствительность и селективность определения специфических ингибиторов холинэстераз - фосфорорганических пестицидов, фторидов, солей тяжелых металлов, в том числе влияние природы носителя фермента, эффекторов обратимого действия, компонентов растительной матрицы, органических растворителей; 

- разработаны тест-методы детектирования присутствия фосфорорганических пестицидов в растительном материале и почвах, оценки загрязненности почв, осадков сточных вод, природных и промышленных сточных вод веществами антихолинэстеразного действия; 

- проведена сравнительная характеристика холинэстеразных биосенсоров и принятых методов биотестирования в оценке токсических свойств загрязнителей окружающей среды; определены условия применения биосенсоров в обобщенной оценке загрязненности природных и сточных вод;

- предложена экспертная система оценки загрязненности (токсичности) вод на основе традиционных статистических (дискриминантный анализ) и нетрадиционных (нейрокомпьютерные технологии) методов;

- разработаны новые способы пробоподготовки для ферментативного определения ингибиторов холинэстераз, включающие электрохимическое окисление тионовых пестицидов и экстракцию пестицидов из почв и растительных объектов с последующим измерением ингибирующего эффекта без удаления органического растворителя.

Основные экспериментальные результаты, все теоретические разработки, выводы и рекомендации выполнены лично автором. 

Научная новизна  работы заключаются в том, что:

- развиты теоретические основы функционирования и методологические основы практического применения электрохимических биосенсоров для определения ингибиторов гидролитических ферментов - загрязнителей окружающей среды;

- на основании комплексного изучения поведения разработанных холинэстеразных биосенсоров, стабилизированных препаратов ферментов установлена роль гетерогенных факторов, определяющих вариации аналитических характеристик определения обратимых и необратимых ингибиторов в стационарных и проточных условиях;

- предложены новые подходы к оптимизации конструкции биосенсора, условий инкубирования и измерения сигнала, позволяющие регулировать процессы переноса субстрата и эффектора на границе мембрана - раствор и благодаря этому направленно регулировать чувствительность и селективность определения ингибиторов различного механизма действия, в том числе при их совместном присутствии в растворе, а также оптимизировать условия определения ингибиторов смешанного механизма действия;

- на основе установленных критериев режима реагирования предложен метод выделения кинетических параметров ингибирования с помощью потенциометрических биосенсоров и охарактеризовано влияние материала носителя на кинетику обратимого и необратимого ингибирования холинэстеразы;

- впервые проведена сравнительная характеристика холинэстеразных биосенсоров и методов биотестирования, показаны возможности и перспективы применения холинэстеразных биосенсоров в контроле объектов окружающей среды и промышленных сточных вод, в том числе для обобщенной оценки загрязнения;

- разработана и реализована концепция экспертной системы оценки загрязненности (токсичности) промышленных сточных вод на основе совместного рассмотрения обобщенных гидрохимических, биологических показателей и антихолинэстеразной активности вод; проведена сравнительная оценка математических методов классификации, использованных для построения экспертной системы.

Практическая значимость работы состоит в том, что:

- апробированы разработанные методы получения накладных ферментсодержащих мембран, отличающихся улучшенными операционными и аналитическими характеристиками, а также конструкции потенциометрических и амперометрических биосенсоров на их основе;

- предложены ферментативные методики тест-определения фосфорорганических пестицидов, ионов тяжелых металлов, гидразониевых солей диалкилдитиофосфатов, аминофосфонатов на основе  холинэстеразы и карбоксилэстеразы, включенных в пленки полисахаридов (N-фталилхитозан, полиглюкин, декстран), предназначенные для быстрого полуколичественного определения фосфорорганических пестицидов в воде, почвах и растительном материале и отличающиеся устойчивостью при хранении и использовании, в том числе в полевых условиях с визуальной индикацией сигнала;

- разработан метод электрохимической активации тионовых фосфорорганических пестицидов, позволяющий улучшить аналитические характеристики их определения, а также моделировать процессы разложения неустойчивых токсикантов при тестировании очищенных сточных вод;

- предложены упрощенные методики экстракции пестицидов с последующим их определением ферментативным методом без удаления органических растворителей.

Разработанные биосенсоры, методики получения ферментсодержащих мембран и ферментные тесты на основе стабилизированных препаратов хо­линэстеразы переданы для испытаний и последующего использования во Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт (г.Казань), Институт геохимии и аналитической химии им.В.И.Вернадского РАН (г.Москва), Гидрохимический институт РАН (г.Ростов-на-Дону), Центральную инспекцию аналитического контроля Минприроды РТ (г.Казань), Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН (г.Пермь).

Положения, выносимые на защиту:

1. Выявление экспериментальных факторов, регулирующих чувствительность и селективность определения ингибиторов различного механизма действия с помощью электрохимических биосенсоров на основе холинэстераз в различных условиях инкубирования и измерения ингибирующего эффекта.

2. Теоретическое обоснование путей направленного изменения операционных и аналитических характеристик биосенсоров для решения конкретных задач эколого-аналитического контроля путем варьирования природы носителя фермента, состава реакционной среды, оптимизации условий пробоподготовки и измерения сигнала.

3. Развитие теоретических подходов к определению режима функционирования биосенсора и механизма действия ингибиторов, основанных на сравнительной характеристике кинетических параметров ингибирования и аналитического сигнала биосенсоров в различных условиях функционирования.

4. Новые способы дифференциации сигнала биосенсоров в многокомпонентных средах, способы учета и подавления защитного эффекта обратимых ингибиторов, оптимизация условий определения ингибиторов смешанного механизма действия.

5. Теоретическое обоснование и экспериментальная оценка возможностей применения холинэстеразных биосенсоров для решения задач обобщенной оценки загрязненности природных и промышленных сточных вод, иловых осадков на основе учета влияния компонентов матрицы и сравнительных испытаний с принятыми методами биотестирования.

6. Создание экспертной системы классификации промышленных сточных вод на основе обобщенных гидрохимических, биологических показателей и уровня антихолинэстеразной активности, предназначенной для выявления источника загрязнения и превалирующего токсического действия.

7. Простые, экспрессные и чувствительные способы тест-определения остаточных количеств фосфорорганических пестицидов в воде, почвах, растительной продукции на основе стабилизированных препаратов ферментов и биосенсоров со сменными ферментсодержащими мембранами для использования в лабораторных и полевых условиях.

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на III Всесоюзной конференции "Проблемы разработки и эксплуатации систем и средств контроля загрязнения окружающей среды" (1989, г.Казань), Всесоюзных конференциях "Химические и биологические методы в охране окружающей среды от загрязнения тяжелыми металлами" (Усть-Каменогорск, 1990), "Аналитическая химия объектов окружающей среды (Сочи, 1991, Краснодар, 1998), Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа ЭМА-94 (г.Москва), международных конференциях "Загрязнение окружающей среды. Проблемы токсикологии и эпидемиологии" (Пермь, 1993), "Сенсор-Техно-93" (Санкт-Петербург, 1993), 5 Международном симпозиуме по кинетическим методам в аналитической химии KAS-95 (Москва, 1995), Всероссийской конференции с международным участием "Химическое разоружение-96. Экология и технология. Chem Det-96" (Ижевск, 1996), Международном конгрессе по аналитической химии (Москва, 1997), Международных конференциях по твердотельным сенсорам "Eurosensors VIII" (Тулуза, Франция, 1994), "Eurosensors X" (Лювен, Бельгия, 1996), "Eurosensors-XI" (Варшава, Польша, 1998), Европейских конференция по электроанализу "ESEAC VI" (Дархэм, Англия, 1996), "ESEAC-VII" (Коимбра, Португалия, 1998), Международных симпозиумах НАТО "Применение биосенсоров для прямого определения загрязнителей окружающей среды в полевых условиях" (Смоленице, Словакия, 1997 г.), "Новые направления в развитии биосенсоров" (Киев, Украина, 1998), международных симпозиумах INCO-Copernicus "Применение биосенсоров для анализа загрязнителей окружающей среды" (Коимбра, Португалия, 1998, Кордоба, Испания, 1998), на Международной школе по биоэлектрохимии им. Дж.Милаццо (Сегед, Венгрия, 1997), Международном симпозиуме по ионоселективным сенсорам и биосенсорам (Матрафюред, Венгрия, 1998), на Московском городском семинаре по аналитической химии (1997), Московском городском семинаре по тестовым методам анализа (1998), региональных конференциях, научных конференциях Казанского государственного университета в 1997-1999 гг.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 72 работы, в том числе 22 статьи и 1 авторское свидетельство СССР.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 367 страницах машинописного текста, включает 69 рисунков и 71 таблицу. Состоит из введения, 4 глав, списка использованных библиографических источников и приложения. Библиография включает 363 источника.

 

| Назад | Экспериментальная часть |