2.3. Микробные биотопливные ячейки, работающие в присутствии искусственных медиаторов электронного переноса

 

Восстановители, образующиеся в метаболических процессах в микробных клетках, изолированы от внешнего мира микробной мембраной. Таким образом, контакт микробных клеток с электродом обычно выражается в переносе электрона через клеточную мембрану [30]. Металл-восстанавливающие бактерии Shewanella putrefaciens MR-1, как сообщалось, содержат цитохромы во внешней мембране [31]. Эти электронные переносчики (цитохромы) способны генерировать анодный ток в отсутствии конечных акцепторов электронов в анаэробных условиях [32,33]. Однако, это - довольно редкий пример.

Низкомолекулярные окислители и восстановители могут помочь переносу электронов между пространством бактерии и электродом. Существует множество важных требований, которым должен удовлетворять такой медиатор, чтобы обеспечить эффективный электронный транспорт от бактериальных метаболитов к аноду: (a) медиатор в окисленном состоянии должен легко проникать через бактериальную мембрану, чтобы достигнуть восстановителей внутри бактерий, (b) окислительно-восстановительный потенциал медиатора должен соответствовать потенциалу метаболита - восстановителя (потенциал медиатора должен быть достаточно положительным для обеспечения быстрого электронного переноса от метаболита, но он не должен быть слишком положительным, чтобы предотвратить существенное снижение э.д.с. (c) Медиатор в окисленном состоянии не должен вступать в другие метаболические процессы (не должен ингибировать их и не должен разрушаться в них). (d) Медиатор в восстановленном состоянии должен легко выходить из клетки сквозь бактериальную мембрану. (e) И в восстановленном, и в окисленном состоянии медиатор должен быть химически устойчив в растворе электролита, он должен быть хорошо растворим и не должен адсорбироваться на бактериальных клетках или поверхности электрода. (f) Электрохимическая кинетика процесса окисления восстановленного медиатора на электроде должна быть быстрой (электрохимически обратимой) [8].

Многие органические и металлоорганические соединения были протестированы в комбинации с бактериями для проверки эффективности медиаторного электронного транспорта от внутренних бактериальных метаболитов до анода биотопливной ячейки. Так, тионин обеспечивает электронный перенос от Proteus vulgaris [34-38] и  E. coli.[38,39] Другие органические красители, проверенные на предмет участия в электронном транспорте, включают бензилвиологен, 2,6-дихлорофенолиндофенол, 2-гидрокси-1,4-нафтохинон, феназины (феназин этосульфат, сафранин), фенотиазины (ализарин бриллиантовый синий, N, N-диметил-дисульфонат тионин, метиленовый синий, фенотиазин, толуидиновый синий), и феноксазины (бриллиантовый крезоловый синий, галлоцианин, резоруфин) [36,38-44]. В качестве микробиологического компонента выступали Alcaligenes eutrophus, Anacystis nidulans, Azotobacter chroococcum, Bacillus subtilis, Clostridium butyricum, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, и Staphylococcus aureus, обычно с использованием глюкозы и сукцината в качестве субстратов. Среди проверенных красителей феноксазин, фенотиазин, феназин, индофенол, бипиридильные производные, тионин и 2-гидрокси-1,4-нафтоquinone оказались очень эффективными в поддержании относительно высокого выхода напряжения ячейки  [36]. Также оказалось, что хелатные комплексы железа (например, Fe (III) ЭДТА) успешно перенос электроны в системе с Lactobacillus plantarum, Streptococcus lactis, и Erwinia dissolvens, окисляя глюкозу [45].

 

Примеры бактерий, используемых в биотопливных ячейках при применении мембран-проникающих медиаторов электронного  переноса


Alcaligenes eutrophus


Escherichia coli,
размер снимка 9.5 мкм


Anacystis nidulans


Proteus vulgaris


Bacillus subtilis

- широко распространенная

грамм-положительная бактерия


Pseudomonas putida


Pseudomonas aeruginosa


Streptococcus lactis

 В то время как тионин часто использовался как медиатор микробных биотопливных ячейках, моно - и дисульфонированные производные тионина применяли для определения влияния гидрофильных заместителей на эффективность медиаторного электронного переноса от E. coli к аноду [46]. Замещение  тионина до 2-сульфонированного и 2,6-дисульфонированного тионина приводит к увеличению  эффективности медиаторного электронного переноса. Это увеличение отражено в изменении тока биотопливной ячейки при 560 W   - 0.35 mA, 0.45 mA и 0.6 mA для тионина, моно-и дисульфопроизводных, соответственно. Низкие эффективности биотопливных ячеек, работающих с тионином и 2-сульфотионином были приписаны вмешательству в электронный перенос адсорбции медиатора на микробной мембране. Таблица 2 суммирует схемы и окислительно-восстановительные потенциалы медиаторов электронного переноса, а также константы скорости их восстановления микроорганизмами. Необходимо отметить, что общая эффективность медиаторов электронного переноса зависит также от многих других параметров, и в особенности от электрохимической константы скорости повторного окисления медиатора, которая зависит от материала электрода. 

 

Таблица 2. Окислительно-восстановительные потенциалы электронных реле, используемых в микробных биотопливных ячейках и кинетика их восстановления микробными клетками.a

Медиатор

Структурная формула

Е b
В (отн. н.в.э.)

Скорость восстановления c

мкмоль (г сух.веса)-1с-1

2,6-дихлорфенолиндофенол

+0.217

0.41

Фенализа этосульфат

+0.065

8.57

Сафранин

-0.289

0.07

N,N-диметилдисульфонат тионина

+0.220

0.33

Новый метиленовый синий

-0.021

0.20

Фенотиазинон

+0.130

1.43

Тионин

+0.064

7.10

О-Толуидин Синий

+0.034

1.47

Галлоцианин

+0.021

0.53

Резоруфин

-0.051

0.61

а данные взяты из [38]. b Eo' при pH 7.0 c Восстановление красителя посредством Proteus vulgaris при 30oC,  50 мкМ красителя и 0.10-0.15 мг(сухой вес)/мл микробных клеток. d Окисляемый субстрат - глюкоза.

 

Так как медиатор электронного переноса должен отвечать многим требованиям, некоторые из которых являются взаимоисключающими, невозможно достигнуть идеальных условий для осуществления электронного переноса с бактериальной клетки на электрод. Смесь двух медиаторов может быть полезна для оптимизации эффективности. Раствор, содержащий тионин и комплекс Fe (III) b ЭДТА в качестве медиаторов электронного переноса, был применен для обеспечения электронного переноса от Escherichia coli к аноду, с окислением глюкозы в качестве первичного субстрата [47]. Хотя оба медиатора могут быть восстановлены посредством E. coli, тионин восстанавливается более чем в 100 раз быстрее, чем Fe (III) - ЭДТА. Однако электрохимическое окисление восстановленного тионина намного медленнее, чем окисление Fe (II) - ЭДТА. Поэтому электроны, полученные при окислении глюкозы в присутствии E. coli переносятся главным образом на тионин. Восстановленный тионин быстро окисляется посредством Fe (III)-  EDTA, причем, как было показано, скорость данного процесса очень велика (ket = 4.8´104 M-1s-1). Наконец, восстановленный хелатный комплекс Fe (II) - ЭДТА переносит электроны к аноду посредством электродной реакции Fe (III) ЭДТА / Fe (II) ЭДТА с достаточно большой константой скорости, kel = 1.5´10-2 см с-1. Еще один пример усовершенствованного электронного переноса в присутствии смеси медиаторов - для семейства Bacillus, окисляющих глюкозу в качестве первичного субстрата. Биотопливная ячейка работала в присутствии метилвиологена (MV2+) и 2-гидрокси-1,4-нафтохинона или Fe (III) EDTA [16]. Метилвиологен может эффективно принимать электроны от бактериальных клеток, но его восстановленное состояние (MV+) очень ядовито для бактерий и немедленно ингибирует процесс ферментации. В присутствии второго медиатора, который имеет более положительный потенциал, MV+ эффективно окисляется до MV2+. Восстановленный вторичный медиатор (хинон или Fe (II) ЭДТА) переносит затем электроны к аноду.  

Электрохимическая ячейка требует также усовершенствования электрического контакта между биокаталитической системой и анодом для улучшения выхода по току. Поверхностный контакт может быть увеличен использованием трехмерного анода [48]. Отделение анода было заполнено частицами графита, смешанными с бактериями E. coli, глюкоза выступала в роли первичного источника электронов, и 2-гидрокси-1,4-нафтохинон в качестве диффузионного медиатора. Такой электрод имеет активную поверхностную область, в 27.4 раз большую, чем собственно сам анод, что приводит к пропорциональном уувеличению тока.

Чтобы организовать интегрированный биокаталитический ансамбль в отделении анода биотопливной ячейки, микробные клетки и медиатор электронного переноса должны быть со-иммобилизованы на поверхности анода. Этой цели достигнуть трудно, так как медиатор электронного переноса должен иметь некоторую свободу для достижения внутриклеточного бактериального пространства для взаимодействия с метаболитами. Фактически, со-иммобилизация бактериальных клеток с медиаторами электронного переноса намного труднее, чем со-иммобилизация окислительно-восстановительных ферментов с  соответствующими медиаторами, потому что в случае микробных клеток активные вещества изолированы в пределах клеточной мембраны. Эта проблема решалась несколькими методами. Нейтральный красный (1), известный органический краситель, чтобы быть активным диффузионным медиатором электронного переноса от E. coli [40], был ковалентно пришит к поверхности графитового электрода посредством амидной связи между карбоксильной группой на поверхности электрода и амино-группой красителя [49]  (Рисунок 2 (A)). Модифицированный медиатором электрод использовался как анод в присутствии E. coli, краситель на поврехности обеспечивал электронный перенос от микробных клеток к проводящей подложке в анаэробных условиях. В этом случае электрический контакт существовал только с теми бактериями, которые достигали модифицированной поверхности электрода. Микробные клетки Proteus vulgaris  были ковалентно связаны с окисленной поверхностью углеродного электрода посредством амидной связи между карбоксильными группами на поверхности электрода и аминогруппами микробной мембраны [50] (Рисунок 2 (B)). Электрод, модифицированный прикрепленными микроорганизмами, был применен в качестве анода в биотопливной ячейке в присутствии глюкозы в роли  первичного субстрата - восстановителя и тионина (2) в качестве диффузионного медиатора электронного переноса. Анод, модифицированный микроорганизмами, показал увеличенный выход тока и лучшую стабильность по сравнению с системой, составленной из тех же самых компонентов, но с неиммобилизованными клетками. Элементы с  Desulfovibrio desulfuricans были покрыты полимерным производным виологена и TCNQ (3), адсорбированным на поверхности [51] (Рисунок 2 (C)).   

Рисунок 2. Электрическая проводимость микробных клеток к аноду электрохимической ячейки с использованием медиаторов электронного переноса: (A) диффузионный медиатор, перемещающийся между микробной суспензией и поверхностью анода. (B) диффузионный медиатор, перемещающийся между анодом и микробными клетками, ковалентно пришитыми к электроду. (C) медиатор, адсорбированный на микробных клетках и обеспечивающий электронный перенос от клеток к аноду.

Микробные клетки были также выращены в присутствии различных пищевых субстратов. Например, Proteus vulgaris бактерии были выращены с использованием глюкозы, галактозы, мальтозы, трегалозы и сахарозы в качестве первичных доноров электронов и использовались в биотопливной ячейке с тионином в качестве диффузионного медиатора электронного переноса [34,35,37]. Углеводороды типа н-гексадекана (с использованием Micrococcus cerificans)[52] и метана (с использованием Pseudomonas methanica)[53] также использовались в качестве топлива для поддержания анодного тока в анодном отделении биотопливной ячейки. Показано, что работа биотопливной ячейки в значительной степени зависит от первичного субстрата, используемого в процессе ферментации. Метаболический процесс в бактериях очень сложен, вовлекает много ферментов и может идти различными путями. Показано, что смесь пищевых субстратов может давать даже более высокий извлекаемый ток, чем любой компонент в отдельности [54]. Возможность достижения максимальной топливной эффективности ячейки существует только при изменении углеродного источника, вызывая различные метаболические состояния в микроорганизме. Таблица 3 суммирует электрический выход микробных биотопливных ячеек, работающих с различными медиаторами электронного переноса, обеспечивающими анодный ток, и использующих различные питательные субстраты. 

Таблица 3. Примеры микробных биотопливных ячеек, использующих медиаторы электронного переноса для объединения внутриклеточных процессов электронного переноса с электрохимическими реакциями на аноде.a

Микроорганизм

Питательный

субстрат

Мепдиатор

Напряжение

Ток

(плотность тока)

Анод c

Лит.

Pseudomonas

methanica

CH4

1-нафтол-2- сульфонат

индо-2,6-дихлорфенол

05 - 06 В d

2.8 мкА см-2
(прпи 0.35 В)

Pt чернь,
12.6 см
2

[54]

Escherichia coli

Глюкоза

Метиленовый синий

0.625 В d

-

Pt, 
390 cm
2

[42]

Proteus vulgaris
Bacillus subtilis
Escherichia coli

Глюкоза

тионин

0.64 В d

0.8 мА
(при 560 Вт)

Пористый

углерод,
800 см
2

[36]

Proteus vulgaris

Глюкоза

тионин

350 мВ
(при 100
W
)b

3.5 мА
(при 100 Вт)

Пористый

углерод,
800 см
2

[35]

Proteus vulgaris

Сахароза

тионин

350 мВ
(при 100
W
)b

3.5 мА
(при 100 Вт)

Графит

[34]

Escherichia coli

Глюкоза

тионин

390 мВ
(при 560
W
)b

0.7 мА
(при 560 Вт)

-

[46]

Lactobacillus plantarum
Streptococcus lactis

Глюкоза

Fe(III) ЭДТА

0.2 В d

90 мкА
(при 560
Вт
)b

-

[45]

Erwinia dissolvens

Глюкоза

Fe(III) ЭДТА

0.5 В d

0.7 mA
(при 560
Вт
)b

-

[45]

Proteus vulgaris

Глюкоза

 2-Гидрокси-1,4-нафтахинон

0.75 В d

0.45 мА
(при 1 k
Вт)

 Графитовый войлок,
1
г (0.47
м2 г-1
)

[51]

Escherichia coli

Ацетат

Нейтральный красный

0.25 В d

1.4 мкА cм-2 e

 Графит,
100 cm
2

[40]

Escherichia coli

Глюкоза

Нейтральный красный

0.85 В d

17.7 мкА cм-2 e

Графитовый войлок,
12
г (0.47
м2 г-1
)

[40]

Escherichia coli

Глюкоза

2-Гидрокси-1,4-нафтахинон

0.53 В
(при 10 k
W)

0.18 мА см-2 e

Стеклоуглерод,
12.5 cм
2

[49]

а) В большинстве исследований биотопливный анод был объединен с O2-катодом. b) значение, рассчитанное на основании других данных с использованием закон Ома. c) поверхность анода дается как геометрическая поверхность. d) Измерения с разомкнутой цепью. e) Измерения с замкнутой цепью.

 

Литература:

8. S. Wilkinson, Autonomous Robots, 9, 99 (2000).

16. T. Akiba, H.P. Bennetto, J.L. Stirling, K. Tanaka, Biotechnol. Lett., 9, 611 1987).

30. M.J. Allen, 'Biofuel Cells' in: "Methods in Microbiology", J.R. Norris, D.W. Ribbon (Eds.),  Academic Press, New York, pp. 247-283 (1972).

31. C.R. Myers, J.M. Myers, J. Bacteriol., 174, 3429 (1992).

32. H.J. Kim, M.S. Hyun, I.S. Chang, B.H. Kim, J. Microbiol. Biotechnol., 9, 365 (1999).

33. B.H. Kim, H.J. Kim, M.S. Hyun, D.H. Park, J. Microbiol. Biotechnol., 9, 127 (1999).

34. H.P. Bennetto, G.M. Delaney, J.R. Mason, S.D. Roller, J.L. Stirling, C.F. Thurston, Biotechnol. Lett., 7, 699 (1985).

35. C.F. Thurston, H.P. Bennetto, G.M. Delaney, J.R. Mason, S.D. Roller, J.L. Stirling, J. Gen. Microbiol., 131, 1393 (1985).

36. G.M. Delaney, H.P. Bennetto, J.R. Mason, S.D. Roller, J.L. Stirling, C.F. Thurston, J. Chem. Technol. Biotechnol., 34B, 13 (1984).

37. N. Kim, Y. Choi, S. Jung, S. Kim, Biotechnol. Bioeng., 70, 109 (2000).

38. S.D. Roller, H.P. Bennetto, G.M. Delaney, J.R. Mason, S.L. Stirling, C.F. Thurston, J. Chem. Technol. Biotechnol., 34B, 3 (1984).

39. H.P. Bennetto, J.L. Stirling, K. Tanaka, C.A. Vega, Biotechnol. Bioeng., 25, 559 (1983).

40. D.H. Park, J.G. Zeikus, Appl. Environm. Microbiol., 66, 1292 (2000).

41. I. Ardeleanu, D.G. Margineanu, H. Vais, Bioelectrochem. Bioenerg., 11, 273 (1983).

42. J.B. Davis, H.F. Yarbrough, Jr., Science, 137, 615 (1962).

43. R.A. Patchett, A.F. Kelly, R.G. Kroll, Appl. Microbiol. Biotechnol., 28, 26 (1988).

44. G. Kreysa, D. Sell, P. Krämer, Ber. Bunsenges. Phys. Chem., 94, 1042 (1990).

45. C.A. Vega, I. Fernández, Bioelectrochem. Bioenerg., 17, 217 (1987).

46. A.M. Lithgow, L. Romero, I.C. Sanchez, F.A. Souto, C.A. Vega, J. Chem. Res., Synop., 5, 178 (1986).

47. K. Tanaka, C.A. Vega, R. Tamamushi, Bioelectrochem. Bioenerg., 11, 289 (1983).

48. D. Sell, P. Krämer, G. Kreysa, Appl. Microbiol. Biotechnol., 31, 211 (1989).

49. D.H. Park, S.K. Kim, I.H. Shin, Y.J. Jeong, Biotechnol. Lett., 22, 1301 (2000).

50. R.M. Allen, H.P. Bennetto, Appl. Biochem. Biotechnol., 39, 27 (1993).

51. D.H. Park, B.H. Kim, B. Moore, H.A.O. Hill, M.K. Song, H.W. Rhee, Biotechnol. Techniques, 11, 145 (1997).

52. H.A. Videla, A.J. Arvia, Experientia, 18, 667 (1971).

53. W. van Hees, J. Electrochem. Soc., 112, 258 (1965).

54. M.J. Allen, Electrochim. Acta, 11, 1503 (1966).