3.1. Аноды биотопливных элементов, использующие ферментативные реакции окисления

Электрохимическое окисление топлива может катализироваться ферментами с последующим переносом электрона с электрода. Различные классы ферментов-окислителей требуют собственных молекулярных "инструментов" для установления такого электрического контакта [9,10]. Медиаторы электронного переноса, переносящие электроны между активными центрами ферментов и электродами, как правило, необходимы для FAD-содержащих оксидаз (например, для глюкозооксидазы, GOD).  NAD(P)+-зависимые дегидрогеназы (например, лактатдегидрогеназа, ЛДГ) для установления электрического контакта с электродом требуют присутствия кофактора NAD(P)+ и каталитически активного по отношению к NAD(P)H электрода, обеспечивающего регенерацию NAD(P)+.

 

3.1.1. Аноды, использующие биоэлектрокаталитическое оиксление NAD(P)H

Никотинамидные кофакторы (NAD+ и NADP+) играют важную роль в транспорте электронов в биологических системах, являясь переносчиками электронов и активируя тем самым биокаталитические функции дегидрогеназ, к числу которых относятся большинство оксидоредуктаз.

Применение NADP+-зависимых ферментов (например, лактатдегидрогеназы, КФ 1.1.1.27, алкогольдегидрогеназы, КФ 1.1.1.71, глюкозодегидрогеназы, КФ 1.1.1.118) позволяет использовать в качестве топлива многие органические вещества, такие как  лактат, глюкозу, спирты. Биокаталитическое окисление этих субстратов требует эффективного процесса электрохимической регенерации NADP+ в анодной части биотопливного элемента. Биокаталитически генерируемые кофакторы NAD(P)H, участвующие в анодном процессе транспорта электронов от ферментов к аноду, и последующее электрохимическое окисление восстановленных кофакторов осуществляют биокаталитические функции системы. 

В водном растворе при рН 7.0 термодинамический редокс-потенциал (E°') для NADP+/NADPH составляет -0.56 В (отн. НКЭ). Он достаточно отрицателен для осуществления анодного процесса. Было показано, что процесс электрохимического окисления является практически необратимым и происходит при высоких перенапряжениях -  около 0.4 В, 0.7 В и 1 В отн. нас.к.э. на графитовом, Pt и Au электродах соответственно [9,56]. Значительная адсорбция NAD(P)H и NAD(P)+ (например на платине, золоте, стеклоуглероде и пирографите), как правило, "отравляет" электродную поверхность и препятствует процессу окисления. Более того, NADP+ является ингибитором прямого окисления NADPH, а адсорбированная молекула NADPH может окисляться до нежелательных продуктов (например до димера NAD+), что приводящих к  нарушению регенерации кофактора. Таким образом, некатализируемое электрохимическое окисление NADPH непригодно для использования в реальных биотопливных элементах. Для эффективного элетроокисления NADPH необходим медиаторный электрокатализ [9,56]. Существуют методики иммобилизации, используемые  при создании модифицированных электродов с медиаторами. Молекулы медиатора могут быть напрямую адсорбированы на поверхности электрода, включены в слой полимера или ковалентно связаны с функциональными группами на поверхности электрода [56]. Так, создан биотопливный элемент, основанный на электрокаталитической регенерации NAD+ на модифицированном аноде [57]. Глюкозодегидрогеназу (КФ 1.1.1.47)  иммобилизовали в пористом стекле, расположенном в анодной части биотопливного элемента. Фермент окислял субстрат (глюкозу) при этом вырабатывая восстановленную форму кофактора NADH. Восстановленный кофактор диффундировал к поверхности анода, где окислялся до NAD+. Биокаталитический анод был соединен с платиновым катодом, на котором происходило восстановление ионов водорода. Данный элемент обеспечивал напряжение Voc = 300 мВ и isc = 220 mA см-2 в течение нескольких часов.

Ковалентное связывание редокс-медиаторов в процессе формирования самоорганизующихся мономолекулярных слоев на поверхности золотого электрода обладает важным преимуществом при создании многокомпонентных систем [58]. Так, ПХХ может быть ковалентно связан с аминогруппами мономолекулярного слоя цистамина, формирующегося на поверхности золота (Рисунок 3 (А)). Электрод демонстрирует хорошую электрокаталитическую активность при окисления NADPH, особенно в присутствии катионов Ca2+, являющихся промоторами (Рисунок 3 (Б)) [59]. При формальном потенциале E°'= -0.155 В отн. нас.к.э. при рН 8.0 наблюдается квазиобратимая вольтамперографическая волна, соответствующая двухэлектронному электронному переносу на молекулу хинона. (Рисунок 1 (Б), кривая а). Кулонометрический анализ редокс-волн хинона показывает, что заполнение поверхности электрода ПХХ соответствует значению 1.2´10-10 моль см-2, что типично для мономолекулярного слоя. Найденное значение константы скорости переноса электрона составило ket = 8 с-1. На рисунке 3 (Б), кривая б, показана циклическая вольтамперограмма, полученная на электроде, содержащем ПХХ, при добавлении 10 мМ NADH в присутствии ионов Ca2+. Наблюдается электрокаталитический анодный ток, предполагающий эффективное электрокаталитическое окисление кофактора, уравнения 13 и 14.
Уравнение (13):    NADH + PQQ + H+R  NAD+ + PQQH2

Уравнение (14):    PQQH2R PQQ + 2H+ + 2e- (к аноду)

  NADP+-зависимые ферменты, электрически "соединенные" с поверхностью электрода, способны выполнять роль эффективных биоэлектрокатализаторов окисления NADPH. Например, диафораза (КФ 1.6.4.3) может катализировать окисление NADH в присутствии множества хиноидных соединений, нескольких видов флавиноидов и виологенов, выполняющих функции медиаторов [60]. Константа скорости бимолекулярной реакции  фермента и медиаторов, чьи редокс-потенциалы выше -0.28 В отн. нас.к.э. при рН 8.5, может достигать значений 108 M-1с-1, в предположении что скорость реакции контролируется диффузией. Разработан биотопливный элемент, в котором использованы ферменты, продуцирующие NADH посредством биокаталитического окисления исходного субстрата, и диафораза с медиатором электронного переноса, обеспечивающая биоэлектрокаталитическое окисление NADH до NAD+ [60].  Некоторые NAD+-зависимые ферменты (алкогольдегидрогеназа, КФ 1.1.1.1; альдегиддегидрогеназа, КФ 1.2.1.5; формиатдегидрогеназа, КФ 1.2.1.2) осуществляли последовательность биокаталитических реакций, результатом которых  являлось окисление метанола до формальдегида и далее до CO2 (Рисунок 4). Восстановленный кофактор (NADH), образующийся на всех стадиях, биокаталитически окислялся диафорозой. Диффузионным медиатором электронного переноса для  диафорозы служил бензилвиологен ( BV2+). Он обеспечивал регенерацию фермента и генерировал анодный ток. Полученный таким образом биокаталитический анод был сопряжен с кислородным катодом, что давало замкнутый биотопливный элемент. Итоговым процессом было окисление метанола молекулярным кислородом. Полученный элемент способен обеспечивать Voc = 0.8 В и максимальную плотность тока около 0.68 мВт см-2 при 0.49 В. Следует отметить, однако, что эта мультиферментная система использовалась в неструктурированном виде, т.е. все биокатализаторы находились в элементе в растворимой форме.

Принимая во внимание высокую стоимость кофакторов NAD(P)H/NAD(P)+, практическое применение требует их иммобилизации совместно с ферментами. Тем не менее, ковалентное связывание нативного NAD(P)H/NAD(P)+ с органическими материалами приводит к значительному снижению их функциональной активности в силу ограничения подвижности, необходимой для эффективного взаимодействия с ферментами. Поэтому много внимания уделяется синтезу искусственных аналогов  NAD(P)+ , имеющих функциональные группы, удаленные от биоактивного центра кофактора с помощью линкеров [61,62]. Линкер обычно связан с азотом N6 NAD(P)+ и обеспечивает необходимую гибкость биоактивной части кофакторов, позволяя им взаимодействовать с молекулами фермента. Была изучена взаимосвязь между структурой и активностью модифицированных производных NAD(P)+ в сочетании с различными ферментами и показана эффективность такого подхода [61,63]. Активный анод должен включать в себя три объединенных, электрически связанных компонента: NAD(P)+, фермент, взаимодействующий с ним, и катализатор, обеспечивающий быструю регенерацию кофактора.

Электроды, функционализированные монослоями кофакторов, способны образовывать аффинные комплексы с соответствующими ферментами [64-66]. Эти межфазные комплексы могут быть в дальнейшем зафиксированы кросс-сшивкой, образуя единую биоэлектрокаталитическую матрицу, состоящую из медиаторов, кофакторов и молекул фермента. Были созданы биокаталитические электроды, в которых NAD+-зависимые ферменты образовывали аффинные комплексы с монослоями катализатора/NAD+ [65,66]. Так, на золотом электроде был получен монослой ПХХ, ковалентно  связанный с модифицированным NAD (N6-(2-аминоэтил)-NAD +, 7) (Рисунок 5(А)). Такой электрод удерживает NAD+-зависимые ферменты (такие как, L-лактат дегидрогеназу, ЛДГ, КФ 1.1.1.27) за счет аффинных взаимодействий между кофактором и апоферментом. Эти электроды способны электрокаталитически окислять субстраты (например, лактат). Кросс-сшивка ферментного слоя глутаровым альдегидом повышает стабильность сигнала. Рисунок 5 (B) представляет собой вольтамперограммы, полученные на электроде с нанесенным кросс-сшивкой слоем ПХХ/НАД +/ЛДГ, в отсутствие (кривая а) и в присутствии (кривая b) лактата. Во вставке показана соответствующая градуировочная зависимость амперометрического сигнала электрода, модифицированного слоем, содержащим ЛДГ, от концентрации лактата. Эта система является примером полностью интегрированной устойчивой матрицы, состоящей из фермента, кофактора и катализатора. Комплексообразование NAD+ с ЛДГ выгодным образом располагает фермент на поверхности электрода, тем самым создавая эффективное электрическое взаимодействие между ферментом и электродом, в то время как присутствие ПХХ обеспечивает регенерацию NAD+.

3.1.2. Электроды, модифицированные флавоэнзимами, в качестве анодов: Окисление глюкозы глюкозоксидазой, регенерируемой на электроде, модифицированном мономолекулярным слоем FAD/ПХХ

Электрическую связь редокс-ферментов, которые не позволяют прямой электрический контакт с электродами, возможно установить, используя синтетические переносчики заряда в качестве промежуточных звеньев между редокс-центром фермента и электродом [10]. Общая электрическая эффективность электродов, модифицированных ферментами, зависит не только от свойств медиатора при переносе электронов, но и от звеньев передачи, присутствующих в целой системе. Диффузионное перемещение электронов используется для их транспорта между ферментами-окислителями и анодами биотопливных элементов, осуществляя, таким образом, биоэлектрокаталитическое окисление органических топлив (таких как метанол) [67-69]. Последовательность биокаталитических реакций была использована для поступенчатого окисления метанола до CO2. Для обеспечения более хорошего электронного контакта, медиатор может быть избирательно помещен в наиболее благоприятной позиции между редокс-центром и периферией фермента. В случае поверхностно ограниченных ферментов возможна оптимизация ориентации системы фермент-медиатор относительно поверхности электрода. Не так давно были продемонстрированы новые методы организации электрического контакта между редокс-центром флавоферментов и их окружением, основанные на методе воссоздания [70].

Формирование слоя воссозданного фермента на монослое электронного медиатора FAD было реализовано путем реконструкции апоглюкозоксидазы (апо-ГО) на поверхности электрода, функционализированной монолоем FAD (Рисунок 6(А)) [71,72]. Пирролохинолин хинон (4) ковалентно связывался с монослоем  основания цистамина на поверхности золотого электрода, с последующим присоединением N6-(2-аминоэтил)-ФАД (8) к группам ПХХ. Апо-ГО (полученная экстракцией естественного кофактора окисление FAD из глюкозооксидазы (EC 1.1.3.4)) была затем воссоздана на структуре монослоя ПХХ-FAD с группами FAD, образуя структурно упорядоченный, иммобилизованный на электроде биокатализатор с покрытием поверхности 1.7´10-12 моль см-2. Такой функционализированный воссозданным ферментом и ПХХ-FAD электрод обладал биоэлектрокаталитическими свойствами. На рисунке 6(В) отображены циклические вольтамперограммы этого электрода в отсутствие и присутствии глюкозы (кривые a и b, соответственно). При наличии субстрата-глюкозы наблюдается анодный ток, что подразумевает элетрический контакт между воссозданным ферментом и поверхностью электрода. Электрод постоянно оксисляет ПХХ группы находящиеся на периферии фермента, а окисление FAD, опосредованное ПХХ, активирует биоэлектрическое окисление глюкозы (уравнения 15-17). Величина результирующего электрического тока определяется скоростью цикла восстановления FAD субстратом. Вставка рисунка 6(В) градуировочную кривую, соответствующую амперометрическому сигналу электрода с воссозданным ферментом при различных концентрациях глюкозы. Плотность тока в данном случае беспрецедентно высока и составляет 300 мА см-2 при концентрации глюкозы 80 мМ.

Уравнение (15):    ФАД + глюкоза + 2H+R  ФАДH2 + глюконовая кислота

Уравнение (16):    ФАД H2 + ПХХ  R  ФАД + ПХХH2

Уравнение (17):    ПХХH2R  ПХХ + 2H+ + 2e- (к аноду)

Контрольные опыты показывают, что без ПХХ система не обнаруживает взаимодействия (переноса электрона) с поверхностью электрода, что служит доказательством участия модификатора в процессе электроокисления глюкозы [71,72]. Каталитическое число ГО при переносе электронов с молекулярным кислородом в качестве акцептора электронов составляет 600 с-1 при 25°C. При энергии активации 7.2 ккал моль-1, каталитическое число переноса электронов ГО при 35°C оценивается  в  900 с-1 [71,72]. Можно ожидать, что плотно упакованный мономолекулярный слой ГО (1.7 10-12 моль см-2) при теоретической скорости электронного переноса будет генерировать амперометрический сигнал с плотностью тока около 300 мА см-2. Это означает, что реконструированная на мономолекулярном слое ПХХ-FAD глюкозооксидаза демонстрирует скорость электронного переноса,  сравнимую по эффективности со скоростью, наблюдаемой при взаимодействии фермента и кислорода в качестве природного акцептора электронов. Действительно, высокое значение тока сохраняется даже при наличии в растворе O2.

Литература:

9. P.N. Bartlett, P. Tebbutt, R.C. Whitaker, Prog. Reaction Kinetics, 16, 55 (1991).

10. I. Willner, E. Katz, Angew. Chem. Int. Ed., 39, 1180 (2000).

56. I. Katakis, E. Dominguez, Mikrochim. Acta, 126, 11 (1997).
57. B. Person, L. Gorton, G. Johansson, A. Torstensson, Enzyme Microb. Technol., 7, 549 (1985).

58. I. Willner, A. Riklin, Anal. Chem., 66, 1535 (1994).

59. E. Katz, T. Lötzbeyer, D.D. Schlereth, W. Schuhmann, H.-L. Schmidt, J. Electroanal. Chem., 373, 189 (1994).

60. G.T.R. Palmore, H. Bertschy, S.H. Bergens, G.M. Whitesides, J. Electroanal. Chem., 443, 155 (1998).

61. M. Maurice, J. Souppe, New J. Chem., 14, 301 (1990).

62. A.F. Bückmann, V. Wray, Biotechnol. Biochem., 15, 303 (1992).

63. J. Hendle, A.F. Bückmann, W. Aehle, D. Schomburg, R.D. Schmid, Eur. J. Biochem., 213, 947 (1993).

64. A.B. Kharitonov, L. Alfonta, E. Katz, I. Willner, J. Electroanal. Chem., 487, 133 (2000).

65. E. Katz, V. Heleg-Shabtai, A. Bardea, I. Willner, H.K. Rau, W. Haehnel, Biosens. Bioelectron., 13, 741 (1998).

66. A. Bardea, E. Katz, A.F. Bückmann, I. Willner, J. Am. Chem. Soc., 119, 9114 (1997).

67. E.V. Plotkin, I.J. Higgins, H.A.O. Hill, Biotechnol. Lett., 3, 187 (1981).

68. G. Davis, H.A.O. Hill, W.J. Aston, I.J. Higgins, A.P.F. Turner, Enzyme Microb. Technol., 5, 383 (1983).

69. P.L. Yue, K. Lowther, Chem. Eng. J., 33, B69 (1986).

70. A. Riklin, E. Katz, I. Willner, A. Stocker, A.F. Bückmann, Nature, 376, 672 (1995).

71. I. Willner, V. Heleg-Shabtai, R. Blonder, E. Katz, G. Tao, A.F. Bückmann, A. Heller, J. Am. Chem. Soc., 118, 10321 (1996).

72. E. Katz, A. Riklin, V. Heleg-Shabtai, I. Willner, A.F. Bückmann, Anal. Chim. Acta, 385, 45 (1999).