6. Электронный перенос с участием ферментов с ковалентно связанными медиаторами

Химическая модификация оксидоредуктаз  электропроводящими группами обеспечивает недиффузионный перенос электрона с участием медиаторов, часто называемый "электрическим контактом" белка (wiring) [1,2,3] (рис.1а).  

Рисунок 1: (А) Растворенный фермент контактирует с электродом посредством медиаторных групп, ковалентно связанных с белковой глобулой. (B)-(F) Различные типы редокс-медиаторов, по разному связанных с белком. (B) Ферроцен, пришитый к аминогруппе лизина посредством амидной связи. (C) Комплекс осмия, привязанный к аминогруппе лизина посредством амидной связи. (D) Ферроцен, привязанный с помощью основания Шиффа к альдегидной группе, образующейся при окислении гликопротеина иодатом. (E) Ru(bpy)2Cl2 связан с остатками гистидина за счет образования комплекса  Ru(bpy)3His. (F) Рутениевый комплекс, связанный пиридиниевой группой путем лигандного обмена.

 

Ковалентная связь электропроводящего фрагмента как на периферии белка, так и внутри глобулы облегчает перенос электрона на короткие дистанции. Электронный скачок (или туннельный перенос) обеспечивает электрическую связь между редокс-центром фермента и его окружением. В простейшем случае модифицированные таким образом ферменты остаются в диффузионном контакте с электродом [1], однако в более сложных случаях формируются интегрированные системы с иммобилизованными ферментами на поверхности соответствующих преобразователей сигнала [4].

Растворенные оксидоредуктазы, функционализированные медиаторами электронного переноса

 

Глюкозооксидаза была ковалентно модифицирована ферроценом путем карбодиимидного связывания ферроценовой кислоты [1] (рис.1В) или комплексом осмия {Os(бис-4,4'-диаминобутан-N,N-бис-2-пиридил-11-аминоундекановая кислота}(8) [5] (рис.1С). Связывание проходило по аминогруппе белковой части фермента. Могут использоваться также другие способы модификации. Например, карбонильные группы, получаемые окислением периодатом в гликопротеинах (например, в глюкозооксидазе) , могут сочетаться с амино-функционализированным ферроценом (9) с помощью основания Шиффа (рис.1D) [2]. В другом подходе комплексы рутения (10,11) связываются с глюкозооксидазой посредством или остатков гистидина [6] (рис.1E) или искусственно вводимых пиридиниевых групп [1b] (рис. 1F). Неупорядоченно расположенные ферроценовые группы обеспечивают электрический контакт редокс-центра глюкозооксидазы с поверхностью электрода. Это выражается в генерировании тока, который можно измерить с помощью циклической вольтамперометрии и использовать для построения градуировочной зависимости определения глюкозы. (рис.2).

 

Рисунок 2: Электрический контакт глюкозооксидазы посредством ферроцена, соединенного с белковой частью  через остатки лизина (ср. рис.1B). (A) Циклические вольтамперограммы золотого электрода в присутствии модифицированной глюкозооксидазы (10 мг/мл) и (a) 0, (b) 0.8 и (c) 5 мМ глюкозы. 0.085 М фосфатный буферный раствор, pH 7.0, под аргоном. (B) Зависимость биокаталитического тока от концентрации глюкозы, измерения при  0.26 В отн. нас.к.э.

 

Было показано, что удлинение цепочки (спейсера), связывающей медиатор и фермент, обеспечивают большую их подвижность, сокращают расстояние переноса электрона, а следовательно, повышают эффективность биоэлектрокатализа (рис.3) [2]. Частичное обратимое развертывание глобулы фермента (с помощью мочевины) в процессе ковалентной модификации белка медиатором также имеет значение, поскольку обеспечивает доступ переносчика электрона к внутренним частям фермента, ближе к активному центру. [7]. 

Рисунок 3: Циклические вольтамперограммы, регистрированные на золотом электроде в присутствии 2 мг/мл глюкозооксидазы, модифицированной ферроценом, связанным через остатки лизина в отсутствие глюкозы (а) и в присутствии 40 мМ глюкозы для различного числа единиц спейсера: n=2 (b), n=3 (c) и n=8 (d) (ср.рис.1D). 0.1 М фосфатный буферный раствор, рН 7.2, под аргоном, скорость развертки потенциала 10 мВ с-1.

При увеличении нагрузки медиатора в расчете на белок увеличивается и эффективность электрического контакта, но активность самого фермента может уменьшаться из-за неблагоприятных изменений в его структуре. Химическая модификация оксидоредуктаз синтетическими медиаторами электронного переноса всегда сопровождается денатурацией части белка. Поэтому следует строго контролировать условия модификации, добиваясь оптимума нагрузки и ферментативной активности. Так, для глюкозооксидазы и ферроцена оптимуму соответствует присоединение 12-13 центров переноса электрона на молекулу белка [7]. Скорость переноса электрона между кофактором фермента ФАД и ближайшим остатком ферроцена составила порядка 0.9 с-1 (значительно меньше, чем в случае электронного переноса на природный акцептор электронов - молекулярный кислород, соответствующая константа скорости порядка 5x103 с-1)[7]. Дальнейшее повышение эффективности переноса электрона возможно с привлечением арсенала генной инженерии, теоретически позволяющей добиться более благоприятного расположения медиатора относительно структуры белка.

Моно- и полислои ферментов, функционализированные медиаторами электронного переноса

Монослои ферментов могут осуществлять электрический контакт с электродом посредством медиаторов, ковалентно связанных с белками [8,9]. В этом случае медиаторы электронного переноса должны располагаться достаточно близко как к активному центру фермента, так и к электроду, чтобы обеспечить эффективную связь между ними. Так, глутат-ион редуктаза, ковалентно связанная с золотым электродом посредством тиолатных мостиков (рис.4.А), была функционализирована N-метил-N'-карбоксиалкил-4,4'-бипиридиниевыми солями (12). Длина цепочки, обеспечивающей свободу медиатора для его участия в переносе электрона, задавалась спейсером [8]. Электровосстановление бипиридиниевого фрагмента активировало фермент в его реакции восстановления окисленного глутат-иона (GSSG). Эффективность восстановления GSSG зависела от длины цепочки: чем длиннее, тем выше скорость электробиокаталитического восстановления (рис.4В). 

Данное явление получило объяснение в рамках теории электронного переноса: чем длиннее цепочки при бипиридиниевом ионе, тем ближе он может подойти к активному центру фермента и к электроду. Было также показано, что с точки зрения эффективности электронного переноса важно проводить модификацию белка бипиридиниевым медиатором в присутствии мочевины. Последняя частично раскрывает фермент и делает возможным включение в модификацию внутренних остатков лизина. В свою очередь, это обеспечивает "перескок" электрона на редокс-центр белка и в итоге обеспечивает его электрическую связь с электродом [8].

Неорганизованные мультислои фермента, функционализированного медиатором, образуются в процессе кросс-сшивки на поверхности электрода [10]. Так, для этого была использована глюкозооксидаза, модифицированная 2-аминоэтилферроценом (13). Кросс-сшивку проводили на золотом электроде, покрытом п-меркаптоанилином, с помощью глутарового альдегида [10] (рис.5А). Иммобилизованный фермент эффективно переносил электрон с электрода (см. градуировочную кривую на внутренней вставке рис.5В, полученную на модифицированном электроде с помощью циклической вольтамперометрии). 

Более регулярные структуры могут быть получены последовательно на манер послойного нанесения фермента с ковалентной пришивкой медиатора к ферменту. Например, полислой глюкозооксидазы был модифицирован (6-ферроценметиламино)гексановой кислотой (14) (рис.6А) [11]. Ферроценовые фрагменты окисляются на электроде и, в свою очередь, окисляют редокс-центр фермента. Величина амперометрического сигнала контролируется числом слоев белка, что косвенно подтверждает предположение, что все слои участвуют в переносе электрона. Поскольку лимитирующей стадией является перенос электрона между субстратом и редокс-центром фермента, сигнал зависит от концентрации глюкозы. Это позволяет использовать такой полислойный ферментный электрод в качестве глюкозного биосенсора (рис.6В, врезка),чувствительность которого можно задавать путем выбора числа слоев фермента в его составе. 

 

Литература к главе 6:

1 a) Y. Degani, A. Heller, J. Phys. Chem. 1987, 91, 1285-1289;

   b) Y. Degani, A. Heller, J. Am. Chem. Soc. 1988, 110, 2615-2620.

2 W. Schuhmann, T.J. Ohara, H.-L. Schmidt, A. Heller, J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 1394-1397.

3 P.N. Bartlett, R.G. Whitaker, M.J. Green, J. Frew, J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1987, 1603-1604.

4 I. Willner, E. Katz, Angew. Chem., Int. Ed. 2000, 39, 1180-1218.

5 S.M. Zakeeruddin, M. Grätzel, D.M. Fraser, Biosens. Bioelectron. 1996, 11, 305-515;

6 E.S. Ryabova, V.N. Goral, E. Csöregi, B. Mattiasson, A.D. Ryabov, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1999, 38, 804-807.

7 A. Badia, R. Carlini, A. Fernandez, F. Battaglini, S.R. Mikkelsen, A.M. English, J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 7053-7060.

8 a) I. Willner, E. Katz, A. Riklin, R. Kasher, J. Am. Chem. Soc.1992, 114, 10965-10966;

   b) I. Willner, N. Lapidot, A. Riklin, R. Kasher, E. Zahavy, E. Katz, J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 1428-1441.

9 E. Katz, A. Riklin, I. Willner, J. Electroanal. Chem. 1993, 354, 129-144.

10 S. Kuwabata, T. Okamoto, Y. Kajiya, H. Yoneyama, Anal. Chem.1995, 67, 1684-1690.

11 I. Willner, A. Riklin, B. Shoham, D. Rivenzon, E. Katz, Adv. Mater. 1993, 5, 912-915.

 

Глава 5

Глава 7