10. Электрический контакт в результате переноса электрона между белками

 

Каскады переноса электрона, реализованные самой природой (например, в дыхательной цепи, рис.1(А) или фотосинтезе, рис. 1(В)) очень эффективны и практически не имеют потерь в виде нежелательных побочных процессов.


Рисунок 1(A): Митохондриальная цепь переноса электрона


Рисунок 1(B): Схема передачи энергии при фотосинтезе в растениях

 

Причина такой высокой эффективности состоит в наличии у молекул белков специальных полостей, с помощью которых они образуют комплексы с носителями заряда. Небольшие молекулы переносчиков электрона недостаточно селективны в электрохимических превращениях, поскольку способны передавать или принимать электроны у самых разнообразных доноров и акцепторов, контактирующих с ними. Напротив, в белках непосредственный контакт редокс-центра возможен лишь со специально организованными субстратами. Поэтому белки могут играть роль переносчиков электронов для тех соединений, которые образуют с ними комплексы, в том числе в присутствии других электрохимически активных молекул. Белки также используются в качестве переносчиков электрона в составе искусственных систем - от обычных диффузионных до полибелковых комплексов.

 

Растворимые цитохромы в качестве медиаторов электронного переноса

Цитохромы, и, в частности, цитохром с (Cyt c), рис.2, - небольшие гем-содержащие белки, способные к селективному переносу электрона между оксидоредуктазами [1].  


Рисунок 2: Цитохром с

Цитохром с - растворимый белок, содержащий геминовую группу. Ее центральный атом железа способен к обратимому  одноэлектронному восстановлению. Гем цитохрома с связан таким образом, что в соответствии с окислительно-восстановительным потенциалом иона железа цитохром с может принимать электрон с одного мембранно-связанного белкового комплекса дыхательной цепи (Комплекс III, цитохром с оксидаза) и переносить его к следующему (Комплекс IV, цитохром с оксидаза)

 

 Перенос электрона между Cyt c и ферментами происходит в особых белковых комплексах [2]. Обратимое электрохимическое поведение Cyt c, включающего частично открытый гем, рис.3, наблюдался на Au-, Pt- и Ag-электродах, модифицированных монослоями различных промоторов [3].


Рисунок 3: Строение гема цитохрома с

Цитохром с (Cyt c) - это белок, осуществляющий функции переноса электрона, в котором имеются один или несколько геминовых групп, связанных с белковой частью одной, или чащи двумя тиоэфирными связями с участием тиольных групп цистеиновых остатков. Пятый лиганд при атоме железа - всегда гистидиновый остаток. Cyt c демонстрирует широкое разнообразие свойств и участвует во многих окислительно-восстановительных реакциях [4].

 

Обычно эти промоторы связаны с электродом посредством тиольных или дисульфидных групп и включают органическую функциональную группу, которая взаимодействует с остовом цитохрома с. Монослой промотора  препятствует прямому контакту между белком и электродом, а значит, необратимой инактивации белка. Кроме того, взаимодействия между промотором и белком могут привести к особому расположению белка на поверхности, необходимому для достижения нужной короткой дистанции для переноса электрона. Самый распространенный промотор для активации поверхностных электрохимических процессов с участием Cyt c - бис(4-пиридил)дисульфид [5], могут использоваться также некоторые другие дисульфиды и тиолы [6]. Монослои аминокислот и олигопептидов также могут рассматриваться как своеобразные промоторы, обеспечивающие протекание электрохимических реакций с участием Cyt c [7] и других цитохромов [8]. С той же целью использовали имидазол [9], тиофен [10] и иод [11], осажденные на золотом или серебряном электродах. При использовании электрода, модифицированного промотором, растворимый Cyt c способен эффективно и обратимо переносить электрон, катализируя как катодные, так и анодные реакции с участием целой группы ферментов. Примером катодного процесса может служить электровосстановление кислорода в воде, катализируемое переносом электрона на растворенную лакказу 12]. Процесс может включать и более длинную цепь переноса электрона [13] (рис.4(A)).  

Рисунок 4: (A) Биоэлектрокаталитическое восстановление кислорода под действием цитохром оксидазы с использованием Cyt c и Cyt c551 в качестве медиаторов многостадийного переноса электрона. (B) Циклические вольтамперограммы, снятые на золотом электроде, модифицированном промотором, (a) в присутствии Cyt c (5.3 мг мл-1), и (b) после добавления Cyt c551 (0.74 мг мл-1) и лакказы COx (770 нМ). 0.02 M фосфатный буферный раствор, pH 7.0, скорость развертки потенциала 1 мВ с-1, в присутствии кислорода O2.

 

Рис.4(B), кривая 'a', показывает циклическую вольтамперограмму, типичную для обратимого электрохимического поведения Cyt c на золотом электроде в присутствии промотора [13]. Добавление цитохрома c551 (Cyt c551) и цитохромоксидазы (COx, из Pseudomonas aeruginosa) в аэробных условиях дает значительное увеличение катодного тока (кривая b) вследствие межбелкового переноса электрона, приводящего к электрокаталитическому восстановлению кислорода. Нужно отметить, что добавление или только Cyt c551 или только COx к Cyt c каталитического процесса не вызывает. Точно так же, нет электрокаталитического тока в отсутствие кислорода. Таким образом, рассматривая данную цепь по аналогии с природной цепью переноса электрона в митохондриях, можно заключить, что описанный механизм включает: (1) поверхностное электрохимическое восстановление Cyt c на электроде, (2) гомогенный перенос электрона на другой белок, от Cyt c на Cyt c551, (3) электронный перенос с восстановленной формы Cyt c551 на COx, и наконец, (4) электронный перенос с COx на O2 (рис.4(A)). Это иллюстрация того, что и в гомогенных условиях можно обеспечить направленный перенос электрона, если использовать специфические медиаторы. Сходный процесс был реализован при использовании нитритредуктазы при восстановлении NO2- до NO [14].

 

Окислительные биокаталитические процессы в присутствии Cyt c можно проиллюстрировать несколькими примерами. Так, электрохимическое окисление Cyt c в сочетании с лактатдегидрогеназой катализирует окисление L-лактата [15] (Рис.5). Аналогичный электронный транспорт к электроду обеспечивает ферроценмонокарбоновая кислота. И хотя константы скорости переноса электрона между лактатдегидрогеназой и Cyt c- и ферроценовым медиатором близки по величине (6.7x106 М-1с-1 и 5.0x106 М-1с-1, соответственно), процесс, протекающий в присутствии Cyt c, более селективен и не сопровождается побочными реакциями с участием Cyt c.

Рисунок 5: Циклические вольтамперограммы (а) 400 мкМ Cyt c и 10 мМ L-лактата и (b) той же системы после добавления 300 нМ лактатдегидрогеназы. Фосфатный буферный раствор (0.1 M, pH 7.0), скорость развертки потенциала 5 мВ с-1

Специфичность медиаторного процесса может быть использована для регенерации NAD(Р)+ и сочетания последнего с любым NAD(Р)+-зависимым ферментом [16]. Например, NAD(P)H-цитохром-P450-редуктаза окисляет NAD(P)H и далее передает электроны на окисленную форму Cyt c, которая впоследствии вновь образуется на электроде, модифицированном промотором.

 

Монослои гемопротеина как медиаторы переноса электрона

 

Перовой стадией конструирования организованного биоэлектрокаталитического слоя, состоящего из белков-медиаторов и ферментов, является осаждение монослоя белка, выполняющего функции матрицы и одновременно осуществляющего электронный перенос между электродом и последующими слоями белков. С этой целью положительно заряженные молекулы Cyt c сорбировали в монослое с помощью электростатических взаимодействий на отрицательно заряженной поверхности электрода. Заряд поверхности придавал самоорганизующийся слой тиокарбоновой кислоты [16,17]. Специфическое расположение несимметрично заряженного Cyt c в процессе его абсорбции достигается путем использования поддерживающего потенциала на электроде [18]. После иммобилизации молекулы Cyt c сохраняют способность к боковым (латеральным) и вращательным движениям по поверхности электрода, что способствует его взаимодействию с вторичными ферментами. Ковалентное связывание Cyt c в самоорганизующихся слоях обычно приводит к случайной ориентации, поскольку в реакции иммобилизации участвуют сразу множество функциональных групп, окружающий ядро белка [16,19]. Жесткая фиксация молекул Cyt c в этом случае препятствует достижению ими необходимой ориентации при взаимодействии с ферментами. Например, Cyt c, сорбированный  в самоорганизующемся слое на поверхности электрода способен переносить электрон между NAD(P)H-цитохром-Р450-редуктазой и электродом [16] (рис.16).  

Рисунок 6: Циклические вольтамперограммы Cyt c, сорбированного в монослое HS(CH2)10COOH на золотом электроде в растворе, содержащем 50 мкМ NADPH. (a) до и (b) после добавления NADPH-цитохром-P450-редуктазы (48 нМ).  50 мМ трис-буферный раствор, pH 7.7, скорость развертки потенциала 5 мВ с-1.

Молекулы Cyt c, ковалентно связанные с поверхностью, в этом процессе не участвуют. Эти результаты позволили предположить, что электростатически сорбированный Cyt c обладает определенной подвижностью, что позволяет ему менять ориентацию на поверхности электрода в соответствии с условиями переноса электрона. И наоборот, ковалентно связанный Cyt c имеет постоянную, случайно установившуюся в процессе иммобилизации ориентацию, которая не может обеспечивать его участие в реакции в качестве медиатора электронного переноса. Таким образом, положение гемопротеина на поверхности играет важнейшую роль  в обеспечении взаимодействия между белками и ферментами и между ферментом и электродом.

 

Монослои микропероксидазы-11

 

Микропероксидаза-11 (МР, 3) состоит из участка, примыкающего к активному центру цитохрома c [20], ее получают путем расщепления трипсином исходного гемопротеина, рис.7. Несмотря на структурное сходство MP-11 и цитохрома с, тем не менее, редокс-потенциалы соответствующих геминовых участков отличаются весьма заметно (E°= -0.40 В отн. нас.к.э. для MP-11 [21] и +0.012 В отн. нас.к.э. для цитохрома с [3,22]).  

Рисунок 7: Структура микропероксидазы-11

Микропероксадаза-11 в виде монослоя на поверхности золотого электрода [21,23] обеспечивает аффинные взаимодействия с гемопротеинами и цитохром-зависимыми ферментами [24]. Монослой MP-11 формирует такой комплекс с нативной нитратредуктазой (цитохром b5-зависимый фермент, NR, из Escherichia coli). При этом достигается поверхностная концентрация NR 3.8x10-12 моль см-2 [23]. Константа ассоциации комплекса MP-11/NR определялась с помощью кварцевого электрорезонатора (QCM) и оказалась равной Ka=3.7x103 М-1. Кросс-сшивка аффинного комплекса глутаровым альдегидом дает стабильный ферментный электрод с прямым электронным переносом с белка, который осуществляет биоэлектрокаталитическое восстановление нитрата до нитрита (рис.8(A)). Биоэлектрокаталитическая реакция протекает с выходом по току до 85%, используемый для этого ферментный электрод может также служить ферментным амперометрическим сенсором на нитрат (рис.8(B)). 

Рисунок 8: (A) Конструкция интегрированного нитратного электрода, полученного путем кросс-сшивки аффинного комплекса микропероксидазы-11 и NR глутаровым альдегидом на поверхности золотого электрода. (B) Циклические вольтамперограммы, полученные на таком электроде: (a) в 0.1 M фосфатном буферном растворе, pH 7.0, (b) в присутствии KNO3, 20 мМ. Скорость развертки потенциала 5 мВ с-1. Врезка: электрокаталитические катодные токи (E = -0.6 В отн. нас.к.э.) для различных концентраций KNO3. Все измерения под аргоном.

 

Co(II)-протопорфирин IX в комплексе с миоглобином также дает аффинное соединение с MP-11, находящейся в монослое на электроде (константа ассоциации Ka=1.6x105 M-1, и константа скорости переноса электрона ket=0.3 с-1[25].  MP-11 обеспечивает электрокаталитическое восстановление комплекса Co(II)-миоглобин,  образующийся гидрид кобальта переносит водород на алкины (например, превращает ацетилендикарбоновую кислоту в малеиновую). Кросс-сшивка миоглобина с центральным атомом Co(II) с помощью глутарового альдегида позволяет получить электрод со стабильным сигналом, относящимся к электрокаталитическому гидрированию ацетилендикарбоновой кислоты с выходом по току 80%.

 

Гем-содержащие белки, синтезированные de novo, в составе монослоев на поверхности электродов

 

Протеины, синтезированные de novo и содержащие в составе геминовые участки, воспроизводят биохимические функции цитохрома b. Они также могут быть участниками реакций на твердых носителях [26]. Возможность контроля их структуры и редокс-свойств делает такие белки перспективными медиаторами электронного переноса между ферментами и электродом. Так, был синтезирован de novo полипептид, состоящий из четырех спиральных участков, способный замещать цитохром b в медиаторных ферментативных реакциях на электроде. Этот белок (14,728 D), содержащий гистидиновые остатки в двух из четырех спиральных участках, был включен в поверхностный слой на золотом электроде (рис. 9(A)). В его состав были введены две молекулы Fe(III)-протопорфирина IX. Полученная система оказалась способной к направленному каскадному переносу электрона [27]. 

Рисунок 9: (A) Строение нитрат-чувствительного электрода, полученного путем кросс-сшивки аффинного комплекса между NR и Fe(III)-протопорфирином, образованным с участием четырехспирального белка, синтезированного de novo. (B) Циклические вольтамперограммы, полученные на таком электроде при концентрациях нитрата, составляющих (a) 0, (b) 12, (c) 24, (d) 46 и (e) 68 мМ. Врезка: градуировочная зависимость амперометрического сигнала электрода для различных концентраций нитрата (E = -0.28 В отн. нас.к.э.). Скорость развертки потенциала 5 мВ с-1, 0.1 M фосфатный буферный раствор, pH 7.0, под аргоном, фактор шероховатости электрода около 20.

 

Такая белковая система, синтезированная de novo, образует аффинный комплекс с цитохром-зависимой  нитратредуктазой (NR) и миоглобином, реконструированным с помощью Co(II)-протопорфирина IX [28]. Образующийся поверхностный комплекс Fe(III)- протеин de novo - NR или Fe(III)- протеин de novo - Co(II)-миоглобин сшиваются глутаровым альдегидом и далее используются для электрокаталитического восстановления NO3- до NO2- (рис.9(B)), комплекс Fe(III)- протеин de novo - Co(II)-миоглобин в составе электрода катализировал гидрирование ацетилендикаробоновой кислоты до малеиновой кислоты.

 

Слои цитохрома с, ассоциированного с цитохромоксидазой

 

Электрическая коммуникация изо-2-цитохрома c (изо-2-Cyt c, из Saccharomyces cerevisiae) достигается путем его ковалентного присоединения к остатку цистеина на монослое малеинимида на поверхности электрода [29]. Константа ассоциации между монослоем изо-2-Cyt c и цитохромоксидазой СОх очень высока (Ka=1.2x107 M-1) [30], что облегчает их взаимодействие на поверхности электрода (рис.10).

Рисунок 10: Кросс-сшивка цитохромоксидазы в составе аффинного комплекса с электродом, покрытым монослоем, содержащим Cyt c, позволяет получить интегрированную систему, катализирующую биоэлектрокаталитическое восстановление кислорода O2.

Электрод с монослоем изо-2-Cyt c сначала реагирует с цитохромоксидазой с образованием аффинного комплекса, плотно упакованного на поверхности электрода (около 2x10-12 моль см-2). Далее его обрабатывают глутаровым альдегидом. Ориентация медиатора на поверхности вдоль сужений на поверхности фермента вследствие плотной упаковки повышает эффективность электронного переноса. Рис.11 показывает циклические вольтамперограммы, отвечающие восстановлению кислорода на различных электродах.

 

Рисунок 11: Циклические вольтамперограммы (a) на чистом электроде, (b) на электроде, модифицированном Cyt c, (c) на электроде с комплексом Cyt c-COx. 0.1 M фосфатный буферный раствор, pH 7.0, скорость развертки потенциала 10 мВ с-1, в присутствии кислорода.

Некаталитическое электрохимическое восстановление кислорода на чистом золотом электроде протекает с перенапряжением (кривая а). Еще большее перенапряжение наблюдается на электроде, покрытом только Cyt c или только COx вследствие частичного блокирования поверхности (кривая  b). Иными словами, если электрод покрыт только Cyt c или COx, электрокаталитического восстановления кислорода не происходит. На электроде, покрытом изо-2 -Cyt c - COx в присутствии кислорода восстановление кислорода протекает при потенциалах отрицательнее -0.07 В отн.нас.к.э. Это говорит о том, что поверхностный слой работает в качестве своеобразного биокатализатора этой реакции. Это достигается благодаря прямому электронному переносу между электродом и цитохромоксидазой через промежуточное участие изо-2-Cyt c. Подобные системы, осуществляющие согласованное четырехэлектронное восстановление кислорода, имеют важное значение в связи с созданием топливных биоэлементов [31].


Литература:

1 R.J.P. Williams, Electron Transfer in Biology and the Solid State, Amer. Chem. Soc., Washington, 1990, pp. 1-23.

2 M. Brunori, Biosens. Bioelectron. 1994, 9, 633-636.
3 a) F.A. Armstrong, H.A.O. Hill, N.J. Walton, Q. Rev. Biophys. 1986, 18, 261-322;
   b) F.A. Armstrong, H.A.O. Hill, N.J. Walton, Acc. Chem. Res. 1988, 21, 407-413;
   c) J.E. Frew, H.A.O. Hill, Eur. J. Biochem. 1988, 172, 261-269.
4 a) G.W. Pettigrew, G.R. Moore, Cytochromes c. Biological Aspects. Springer­Verlag, Berlin, 1987.
   b) G.R. Moore, G.W. Pettigrew, Cytochromes c. Evolutionary, Structural, and Physicochemical Aspects. Springer­Verlag, Berlin , 1990.
5 a) I. Taniguchi, K. Toyosawa, H. Yamaguchi, K. Yasukouchi, J. Chem. Soc., Chem.  Commun. 1982, 1032-1033;
   b) I. Taniguchi, S. Yoshimoto, K. Nishiyama, Chem. Lett. 1997, 353-354;
   c) B.D. Lamp, D. Hobara, M.D. Porter, K. Niki, T.M. Cotton, Langmuir1997, 13, 736-741;
   d) H.A.O. Hill, D.J. Page, N.J. Walton, J. Electroanal. Chem. 1987, 217, 141-158;
   e) Y. Xie, S. Dong, Bioelectrochem. Bioenerg. 1992, 29, 71-79.
6 P.M. Allen, H.A.O. Hill, N.J. Walton, J. Electroanal. Chem. 1984, 178, 69-86.
7 a) Z.-X. Huang, M. Feng, Y.-H. Wang, J. Cui, D.-S. Zou, J. Electroanal. Chem. 1996, 416, 31-40;
   b) R. Santucci, A. Faraoni, L. Campanella, G. Tranchida, M. Brunori, Biochem. J. 1991, 273, 783-786.
8 S. Bagby, P.D. Barker, K. DiGleria, H.A.O. Hill, V.J. Lowe, Biochem. Soc. Transact. 1988, 16, 958-959.
9 G. Li, H. Chen, D. Zhu, Anal. Chim. Acta 1996, 319, 275-276.
10 X. Qu, T. Lu, S. Dong, C. Zhou, T.M. Cotton, Bioelectrochem. Bioenerg. 1994, 34, 153-156.
11 T. Lu, X. Yu, S. Dong, C. Zhou, S. Ye, T.M. Cotton, J. Electroanal. Chem. 1994, 369, 79-86.
12 W. Jin, U. Wollenberger, F.F. Bier, A. Makower, F.W. Scheller, Bioelectrochem. Bioenerg. 1996, 39, 221-225.
13 D.A. Powis, G.D. Wattus, FEBS Lett. 1981, 126, 282-284.

14 H.A.O. Hill, N.J. Walton, J. Am. Chem. Soc.1982, 104, 6515-6519.
15 A.E.G. Cass, G. Davis, H.A.O. Hill, D.J. Nancarrow, Biochim. Biophys. Acta 1985, 828, 51-57.
16 W. Jin, U. Wollenberger, E. Korgel, W.-H. Schunck, F.W. Scheller, J. Electroanal. Chem. 1997, 433, 135-139.
17 a) M.J. Tarlov, E.F. Bowden, J. Amer. Chem. Soc. 1991, 113, 1847-1849;
     b) D. Hobara, K. Niki, C. Zhou, G. Chumanov, T.M. Cotton, Colloids Surf. A 1994, 93, 241-250;
     c) T.M. Nahir, E.F. Bowden, J. Electroanal. Chem. 1996, 410, 9-13;
     d) S. Song, R.A. Clark, E.F. Bowden, M.J. Tarlov, J. Phys. Chem. 1993, 97, 6564-6572;
     e) P.N. Bartlett, D.J. Caruana, Analyst1992, 117, 1287-1292;
     f) M. Collinson, E.F. Bowden, M.J. Tarlov, Langmuir 1992, 8, 1247-1250.
18 B.A. Kuznetsov, N.A. Byzova, G.P. Shumakovich, J. Electroanal. Chem. 1994, 371, 85-92.
19 J.M. Cooper, K.R. Greenough, C.J. McNeil, J. Electroanal. Chem. 1993, 347, 267-275.
20 a) P.A. Adams, In: Peroxidases in Chemistry and Biology, J. Everse, K.E. Everse (Eds.), CRC Press, Boston, 1991, Vol. 2, Chap. 7, 171-200;
     b) G. Ranghino, G. Antonini, P. Fantucci, Israel J. Chem. 1994, 34, 239-244.
21 T. Lotzbeyer, W. Schuhmann, E. Katz, J. Falter, H.-L. Schmidt, J. Electroanal. Chem. 1994, 377, 291-294.
22 H.A.O. Hill, N.J. Walton, I.J. Higgins, FEBS Lett. 1981, 126, 282-284.
23 F. Patolsky, E. Katz, V. Heleg-Shabtai, I. Willner, Chem. Eur. J. 1998, 4, 1068-1073.
24 A. Narvaez, E. Dominguez, I. Katakis, E. Katz, K.T. Ranjit, I. Ben-Dov, I. Willner, J. Electroanal. Chem. 1997, 430, 217-233.
25 a) V. Heleg-Shabtai, E. Katz, I. Willner, J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 8121-8122;
     b) V. Heleg-Shabtai, E. Katz, S. Levi, I. Willner, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2 1997, 2645-2651.
26 a) A.E. Strong, B.D. Moore, J. Mater. Chem.1999, 9, 1097-1105;
     b) D.L. Pilloud, F. Rabanal, B.R. Gibney, R.S. Farid, P.L. Dutton, C.C. Moser, J. Phys. Chem. B 1998, 102, 1926-1937.
27 E. Katz, V. Heleg-Shabtai, I. Willner, H.K. Rau, W. Haehnel, Angew. Chem. Intern. Ed.  Engl. 1998, 37, 3253-3256.
28 I. Willner, V. Heleg-Shabtai, E. Katz, H.K. Rau, W. Haehnel, J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 6455-6468.
29 V. Pardo-Yissar, E. Katz, I. Willner, A.B. Kotlyar, C. Sanders, H. Lill, Faraday Discuss.  2000, в печати.
30 A.B. Kharitonov, L. Alfonta, E. Katz, I. Willner, Submitted for publication.
31 E. Katz, I. Willner, A.B. Kotlyar, J. Electroanal. Chem. 1999, 479, 64-68.

 

К главе 9

В начало