7. Ферменты, иммобилизованные совместно с медиаторами в полимерной или неорганической матрице

Включение ферментов в органические полимерные или неорганические композитные матрицы обеспечивает очень удобный и стабильный контакт с биокатализатором, что имеет важные практические приложения. Разработано много дешевых и универсальных матриц на основе различных полимеров (например, полипиррола [1-5]) и неорганических соединений (золь-гель матрицы [6,7], графитовые пасты [8,9]). Их импрегнируют медиаторами электронного переноса, кофакторами и другими компонентами, необходимыми для создания биосенсора.

Электрический контакт ферментов с полимерами, содержащими медиаторы

Известно много примеров биоэлектрокаталитических электродов, включающих ферменты в составе полимеров [10,11]. Электрический контакт фермента и электрода достигался либо с помощью электропроводящего полимера, либо при введении в его структуру функциональных групп, обеспечивающих электронный перенос. В этом обзоре внимание будет уделено именно последнему способу, а именно, включению в состав полимера редокс-медиаторов, обеспечивающих контакт фермента и электрода [11]. Простейшим способом это достигается путем включения ионных редокс-групп , например, ферроцианида [12], за счет анионообменных свойств полимера. Совместное включение фермента и анионного медиатора позволяет достичь указанной цели [13,14]. Так, ферроцен-карбоксилат [3]  и пирролохинолин хинон (PQQ) [15] были внедрены в состав поверхностного слоя в процессе электрополимеризации пиррола для обеспечения электрического контакта глюкозооксидазы. Такой подход, однако, не обеспечивает ковалентного связывания медиатора, который может вымываться из полимерной матрицы. Поэтому такие ферментные сенсоры недостаточно стабильны и не могут быть использованы в экспериментах in vivo. Для стабилизации медиаторов в полимерном слое были предложены амфифильные производные пиррола (Рисунок 1, 15-19) [11,16,17]. 

Рисунок 1A: Структуры функционализированных редокс-активными группами производных пиррола, предложенных для включения оксидоредуктаз в процессе электрополимеризации.


Рисунок 1B: Пирролохинолин хинон (PQQ)

Например, производное пиррола, содержащее ферроцен (15), использовали в паре с глюкозооксидазой [11] и пируват оксидазой [18], аналог флавина (16) обеспечивал контакт с флавин редуктазой [19]. Ферменты, участвующие в восстановительных циклах (например, нитратредуктаза, пиридин нуклеотид оксидоредуктаза), взаимодействуют в полимерной матрице с пирролами, функционализированными виологеном (17-19) [16,20]. Нитратредуктаза в паре с виологен-содержащим полимером была успешно использована для амперометрического определения нитратов (Рис.2А, градуировочная кривая на рис.2В).

Рисунок 2: (A) Амперометрический сигнал (a) электрода на основе полипиррола, модифицированного виологеном, и нитратредуктазы. (b) Тот же электрод в отсутствие фермента, отклик на введение (x) возрастающих концентраций нитрата (по 3.5 мкМ) и буферного раствора (y). (B) Градуировочная кривая (врезка - область малых концентраций) нитрата, регистрация сигнала при -0.7 В отн. нас.к.э.

 

Другой подход к обеспечению электрического контакта фермента, связанного полимером, - внесение в состав полимеров заместителей, содержащих редокс-активные группы [21,22]. С этой целью лучше всего использовать полиэлектролиты. Гидрофильные, заряженные, гибкие цепи полиэлектролитов легко облегают белковые молекулы, в некоторых случаях даже проникают внутрь белковой матрицы, и тем самым обеспечивают хороший контакт между белком и основной цепью полимера (Рисунок 3). 

Рисунок 3: Оксидоредуктаза, электрический контакт которой с электродом обеспечивается гибкими полимерными цепями, функционализированными медиаторными группами и охватывающими фермент на поверхности электрода.

 

Каждый элемент полиэлектролита слабо сорбирован на электроде, но кооперативный эффект всего полимера приводит к сильной адсорбции, хотя при этом отдельные его цепи могут оставаться свободными, что обеспечивает возможность связи с молекулами белка. Трехмерные решетки полиэлектролитов с редокс-группами обеспечивают контакт  редокс-центров фермента с электродом, что находит применение в ряде конструкций сенсоров [23,24], например, с использованием гидрофильных эпоксидных композитов [24]. В этом случае полимер состоит из поливинилпиридинового костяка, в котором приблизительно каждый шестой пиридиниевый фрагмент включен  в состав комплекса с [Os(bpy)2Cl]2+, а примерно каждый пятый включен в реакцию с 2-бромэтиламином с образованием пиридиний-N-этиламин поликатионного домена (20). Этот полиэлектролит с редокс-свойствами легко взаимодействует с ферментами (например, лактат оксидазой, глицеро-3-фосфат оксидазой, целлобиозооксидазой) [21,25]. Хотя отрицательно заряженные ферменты могут сильно взаимодействовать с поликатионным полимером даже без кросс-сшивки, последнюю используют для дополнительной стабилизации системы. С этой целью применяют диэпокси(полиэтиленгликоль)диглицидиловый эфир (21). Например, таким способом в состав сенсора была включена глюкозооксидаза. Биосенсор показал электрокаталитический анодный ток в присутствии глюкозы (рис.4А, градуировочная кривая на врезке ). Аналогичным образом использовали положительно заряженный сополимер аллиламина и акриловой кислоты, функционализированной ферроценом, после связки диальдегидом в присутствии глюкозооксидазы [26]. Генерируемый анодный ток окисления глюкозы приведен на рис.4..  

Рисунок 4: (A) Циклические вольтамперограммы, полученные на графитовых микроэлектродах (диаметр 7 мкм), модифицированных  комплексами Os, содержащими полимер (20), связанный путем  кросс-сшивки бис-эпоксидным реагентом с глюкозооксидазой: (a) в отсутствие глюкозы (b) при добавлении к мМ глюкозы. Скорость развертки потенциала 5 мВ/с. Врезка: градуировочная кривая амперометрического определения глюкозы при потенциале 0.4 В отн.нас.к.э. (B) Циклические вольтамперограммы на электродах, модифицированных полиаллиламином, содержащим ферроцен и глюкозооксидазу: (a) в отсутствие глюкозы и при добавлении 1 мМ (b) и 3 мМ (c)  глюкозы. Скорость развертки потенциала 5 мВ/с. Врезка: амперометрический отклик ферментного электрода (при потенциале 0.6 В) на последовательное добавление глюкозы (числа показывают концентрацию глюкозы в мМ).

Нейтральный полиакриламид, несущий ферроценовые заместители, был использован для включения молекул глюкозооксидазы без помощи электростатических взаимодействий [22]. Кроме того, описано много других полимеров, функционализированных редокс-группами (например, хинонами [27], которые использовали для обеспечения электрического контакта оксидоредуктаз. Эффективное включение ферментов достигалось в процессе свободнорадикальной полимеризации редокс-гидрогелей, - эффективной альтернативы электрополимеризации [28].

 

Включение ферментов в золь-гель матрицы, содержащие медиаторы электронного переноса

Золь-гель матрицы - идеальные кандидаты для конструирования ферментсодержащих систем. Они химически инертны, устойчивы к набуханию, получаются при низких температурах, имеют легко регулируемую пористость [6]. В настоящее время наиболее интенсивно изучаются матрицы на основе силиконалкоксидов как наиболее дешевых реагентов, обеспечивающих к тому же достаточно медленное протекание реакции. Используя их, удалось получить силикатные золь-гели, содержащие самые различные допирующие реагенты  (например, ферменты, медиаторы электронного переноса, кофакторы, промоторы и т.д.). Характеристики конечного продукта регулируются на стадии получения (рН, соотношение мономеров и т.д.).Так, глюкозооксидаза была включена в золь-гель матрицу , содержащую ферроцен [29]. Свыше 80% фермента в составе золь-геля сохранило активность. Амперометрический сигнал соответствовал теоретическому. Создание таких золь-гель/ферментных мультислоев на электроде позволило получить отклик на глюкозу [30] и L-лактат [31] в широком диапазоне их концентраций.

Рисунок 5: Включение молекул фермента в состав золь-гель матрицы, содержащей редокс-медиаторы (A), и с добавлением частиц электропроводящего графита или металла (B).

Электрические характеристики подобных пленок могут быть улучшены путем внедрения в них электропроводящих материалов, таких как графитовый порошок или частицы металла (Рис.5(B)). Электроды, приготовленные с такими добавками, имеют преимущество по сравнению с использованием силикатных матриц в отношении пористости и механической прочности, а также за счет проводимости добавок [6]. Композитные золь-гель электроды, содержащие глюкозооксидазу и соиммобилизованные  медиаторы были использованы в качестве глюкозных биосенсоров [32-35]. Для этого редокс-медиатор или добавлялся на стадии желирования (и в результате физически включался в структуру силиката) [33] или химически присоединялся к силикатной основе (пример -  N-(3-триметилсилоксипропил)ферроценилацетамид (22) в качестве функционализированного таким образом мономера) [35]. Электронный перенос с белковой основой может также достигаться  до синтеза матрицы. Например, модифицированная таким образом глюкозооксидаза включалась в композиты на основе графита и золь-геля [34,36]. Модификация обеспечивала перенос электрона между активным центром фермента и ближайшей частицей графита, а графит обеспечивал электропроводность всего слоя на электроде. Таким образом, ферроцен электрически связывал глюкозооксидазу и электрод и давал амперометрический сигнал в присутствии глюкозы [7] (рис.6). Металлические частицы, улучшающие проводимость матрицы, часто контактируют с графитовым токосъемником, покрытым тонким слоем металла (например, палладия или родия) [37]. Недавно предложено использовать вместо частиц металла наночастицы золота, соединенные с ферментом в пористой силикатной матрице [38].  

Рисунок 6: Сигнал электрода, модифицированного глюкозооксидазой и ферроценом в золь-гель матрице: циклическая вольтамперограмма до (а) и после (b) добавления 10 мМ глюкозы, фосфатный буферный раствор, pH 5.6; скорость развертки потенциала 10 мВ/с.

 

Ферменты в композитах на основе графитовой пасты, содержащей медиаторы

Амперометрические биосенсоры на основе угольно-пастовых электродов получили очень широкое распространение в последнее десятилетие [8,9]. Действительно, они допускают простое смешение фермента, медиатора и проводящего порошка для получения необходимого результата. Модификация электрода толстым слоем угольной пасты дает возможность регенерации инактивированной поверхности путем ее полировки или механического обновления для восстановления полностью активной поверхности. Это очень привлекательно, особенно по сравнению с электродами, модифицированными тонкими пленками, которые требуют полного изготовления заново или повторной модификации поверхности. Главная проблема в изготовлении таких толстопленочных угольно-пастовых электродов - обеспечение эффективного электрического контакта внутри слоя. С этой целью в нее вносятся медиаторы -  или с ферментом (например, глюкозооксидазой), или отдельно. Примером может служить использование производных ферроцена [39] (мономерных или полимерных), бензохинона или полимеров, модифицированных бензохиноном [40,41], производных виологена [42], тетратиафульвалена (TTF) [43], тетрацианохинодиметана (TCNQ) [44], органических солей TTF-TCNQ [45], фталоцианина кобальта [46], Meldola blue [47], метиленового зеленого [48], гексацианоферрата меди [49] и др. [8,9]. Помимо глюкозооксидазы, в состав графитовых паст с подходящими медиаторами могут включаться и другие оксидоредуктазы [9]. В ряде случаев медиаторы функционируют при достаточно низких потенциалах (особенно виологены [42]) , чтобы обеспечить эффективное окисление FADH2  при потенциалах, исключающих влияние неспецифического окисления примесей. Использование NAD+-зависимых ферментов (глюкозодегидрогеназы [50], алкогольдегидрогеназы [51]) требует включения NAD+ и катализатора для окисления NADH. Угольно-пастовые электроды также используются в качестве матрицы при создании мультиферментных устройств. Например, ацетилхолинэстеразу и холиноксидазу включали в пасту, содержащую TTF [52]  или ферроценсодержащие полимеры [53]  как медиаторы электронного переноса. Гидролиз ацетилхолина под действием ацетилхолинэстеразы приводил к образованию холина, окисляющегося далее под действием холиноксидазы, давал амперометрический сигнал на ацетилхолин. Тем  не менее, следует указать, что угольные пасты не являются общим способом достижения любой желаемой комбинации. Некоторые ферменты, такие как фруктозодегидрогеназа [40,54] и альдозодегидрогеназа [55], при включении в пасту теряют слишком много активности. Эти ферменты можно закрепить на поверхности предварительно изготовленных угольно-пастовых электродов, но такая процедура не реализует многие из преимуществ угольно-пастовых электродов [8,9]. Конструкция и оптимизация состава многокомпонентных матриц, состоящих из порошка графита, органических масел, редокс-медиаторов, кофакторов, ферментов и т.д. являются предметом постоянного интенсивного исследования.

Литература к главе 7:

1 N.C. Foulds, C.R. Lowe, J. Chem. Soc., Faraday Trans. 1 1986, 82, 1259-1264.

2 M. Umaña, J. Waller, Anal. Chem.1986, 58, 2979-2983.

3 C. Iwakura, Y. Kajiya, H. Yoneyama, J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1988, 1019-1020.

4 F. Mizutani, M. Asai, Bull. Chem. Soc. Jpn. 1988, 61, 4458-4460.

5 S.-I. Yabuki, H. Shinohara, M. Aizawa, J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1989, 945-946.

6 D. Avnir, S. Braun, O. Lev, M. Ottolenghi, Chem. Mater. 1994, 6, 1605-1614.

7 A. Walcarius, Electroanalysis 1998, 10, 1217-1235.

8 K. Kalcher, J.-M. Kauffmann, J. Wang, I. Svancara, K. Vytras, C. Neuhold, Z. Yang,  Electroanalysis 1995, 7, 5-22.

9 L. Gorton, Electroanalysis 1995, 7, 23-45.

10 a) S. Cosnier, Electroanalysis1997, 9, 894-902;

     b) C. Kranz, H. Wohlschläger, H.-L. Schmidt, W. Schuhmann, Electroanalysis 1998, 10, 546-552.

11 S. Cosnier, Biosens. Bioelectron.1999, 14, 443-456.

12 a) H. Mao, P.G. Pickup, J. Electroanal. Chem. 1989, 265, 127-142;

     b) G. Lian, S. Dong, J. Electroanal. Chem. 1989, 260, 127-136;

     c) S. Dong, G. Lian, J. Electroanal. Chem. 1990, 291, 23-29.

13 W. Schuhmann, Mikrochim. Acta 1995, 121, 1-29.

14 S. Yabuki, H. Shinohara, M. Aizawa, J. Electroanal. Chem. 1990, 277, 179-187.

15 M.G. Loughram, J.M. Hall, A.P.F. Turner, Electroanalysis1996, 8, 870-875.

16 S. Cosnier, C. Innocent, Y. Jouanneau, Anal. Chem. 1994, 66, 3198-3201.

17 a) S. Cosnier, L. Allien, L. Coche-Guérente, C. Innocent, P. Labbé, P. Mailley, Sens. Mater. 1996, 8, 169-177;

     b) S. Cosnier, B. Galland, C. Innocent, J. Electroanal. Chem. 1997, 433, 113-119.

18 N. Gajovic, K. Habermüller, A. Warsinke, W. Schuhmann, F.W. Scheller, Electroanalysis 1999, 11, 1377-1383.

19 S. Cosnier, J.-L. Décout, M. Fontecave, C. Frier, C. Innocent, Electroanalysis 1998, 10, 521-525.

20 a) T. Parpaleix, J.M. Laval, M. Maida, C. Bourdillon, Anal. Chem. 1992, 64, 641-646;

     b) I. Willner, E. Katz, N. Lapidot, P. Baüerle, Bioelectrochem. Bioenerg. 1992, 29, 29-45;

     c) G. Ramsay, S.M. Wolpert, Anal. Chem. 1999, 71, 504-506.

21 A. Heller, J. Phys. Chem. 1992, 96, 3579-3587.

22 H. Bu, S.R. Mikkelsen, A.M. English, Anal. Chem. 1995, 67, 4071-4076.

23 B.A. Gregg, A. Heller, Anal. Chem.1990, 62, 258-263.

24 a) B.A. Gregg, A. Heller, J. Phys. Chem.1991, 95, 5970-5975;

     b) B.A. Gregg, A. Heller, J. Phys. Chem. 1991, 95, 5976-5980.

25 I. Katakis, A. Heller, Anal. Chem.1992, 64, 1008-1013.

26 a) E.J. Calvo, C. Danilowicz, L. Diaz, J. Electroanal. Chem. 1994, 369, 279-282;

     b) S. Koide, K. Yokoyama, J. Electroanal. Chem. 1999, 468, 193-201.

27 G. Arai, M. Masuda, I. Yasumori, Bull. Chem. Soc. Jpn. 1994, 67, 2962-2966.

28 S.A. Emr, A.M. Yacynych, Electroanalysis1995, 7, 913-923.

29 P. Audebert, C. Demaille, C. Sanchez, Chem. Mater. 1993, 5, 911-913.

30 T.-M. Park, E.I. Iwuoha, M.R. Smith, B.D. MacCraith, Anal. Commun.1996, 33, 271-273.

31 T.-M. Park, E.I. Iwuoha, M.R. Smith, R. Freaney, A.J. McShane, Talanta1997, 44, 973-978.

32 M. Tsionsky, G. Gun, V. Glezer, O. Lev, Anal. Chem. 1994, 66, 1747-1753.

33 I. Pankratov, O. Lev, J. Electroanal. Chem.1995, 393, 35-41.

34 S. Sampath, I. Pankratov, J. Gun, O. Lev, J. Sol-Gel Sci. Technol.1996, 7, 123-128.

35 a) J. Gun, O. Lev, Anal. Chim. Acta 1996, 336, 95-106;

     b) J. Gun, O. Lev, Anal. Lett. 1996, 29, 1933-1938.

36 S. Sampath, O. Lev, Electroanalysis 1996, 8, 1112-1116.

37 a) S. Sampath, O. Lev, Anal. Chem. 1996, 68, 2015-2021;

     b) S. Sampath, O. Lev, J. Electroanal. Chem. 1997, 426, 131-137.

38 S. Bharathi, O. Lev, Anal. Commun. 1998, 35, 29-31.

39 a) B. Gründig, C. Krabisch, Anal. Chim. Acta 1989, 222, 75-81;

     b) H. Gunasingham, C.-H. Tan, T.-C. Aw, Anal. Chim. Acta 1990 234, 321-330;

     c) P.D. Hale, T. Inagaki, H.I. Karan, Y. Okamoto, T.A. Skotheim, J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 3482-3484;

     d) L. Gorton, H.I. Karan, P.D. Hale, T. Inagaki, Y. Okamoto, T.A. Skotheim, Anal. Chim. Acta 1990, 228, 23-30;

     e) J. Wang, L.-H. Wu, Z.L. Lu, R.L. Li, J. Sanchez, Anal. Chim. Acta 1990, 228, 251-257;

     f) P.D. Hale, L.I. Boguslavsky, T. Inagaki, H.S. Lee, T.A. Skotheim, H.I. Karan, Y. Okamoto, Mol. Cryst. Liq. Cryst.1990, 190, 251-258;

     g) P.D. Hale, L.I. Boguslavsky, T. Inagaki, H.I. Karan, H.S. Lee, T.A. Skotheim, Y. Okamoto, Anal. Chem. 1991, 63, 677-682;

     h) P.D. Hale, H.L. Lan, L.I. Boguslavsky, H.I. Karan, Y. Okamoto, T.A. Skotheim, Anal.Chim. Acta1991, 251, 121-128;

     i) A. Amine, J.-M. Kauffmann, G.J. Patriarche, Talanta1991, 38, 107-110;

     j) A. Amine, J.-M. Kauffmann, G.J. Patriarche, A.E. Kaifer, Anal. Lett. 1991, 24, 1293-1315;

    k) F. Mizutani, S. Yabuki, A. Okuda, T. Katsura, Bull. Chem. Soc. Jpn. 1991, 64, 2849-2851;

     l) S. Sakura, R.P. Buck, Bioelectrochem. Bioenerg. 1992, 28, 387-400;

   m) P.D. Hale, H.S. Lee, Y. Okamoto, Anal. Lett.1993, 26, 1-16;

    n) A. Amine, J.-M. Kauffmann, G.G. Guilbault, S. Bacha, Anal. Lett. 1993, 26, 1281-1299;

    o) I. Rosen-Margalit, J. Rishpon, Biosens. Bioelectron.1993, 8, 315-323;

    p) J. Wang, N. Naser, Electroanalysis 1994, 6, 571-575.

40 a) T. Ikeda, Bull. Electrochem. 1992, 8, 145-159.

41 a) T. Ikeda, I. Katasho, M. Senda, Anal. Sci.1985, 1, 455-457;

     b) T. Ikeda, H. Hamada, K. Miki, M. Senda, Agric. Biol. Chem. 1985, 49, 541-543;

     c) T. Ikeda, H. Hamada, M. Senda, Agric. Biol. Chem. 1986, 50, 883-890;

     d) N. Motta, A.R. Guadalupe, Anal. Chem.1994, 66, 566-571;

     e) T. Inagaki, H.S. Lee, P.D. Hale, T.A. Skotheim, Y. Okamoto, Macromolecules 1989, 22,  4641-4643;

     f) H.I. Karan, P.D. Hale, H.L. Lan, H.S. Lee, L.F. Liu, T.A. Skotheim, Y. Okamoto, Polym.  Adv. Technol. 1991, 2, 229-235;

    g) T. Kaku, H.I. Karan, Y. Okamoto, Anal. Chem.1994, 66, 1231-1235.

42 P.D. Hale, L.I. Boguslavsky, H.I. Karan, H.S. Lee, Y. Okamoto, T.A. Skotheim, Anal. Chim. Acta 1991, 248, 155-161.

43 a) H. Gunasingham, C.-H. Tan, Analyst 1990, 115, 35-39;

     b) H. Gunasingham, C.-H. Tan, T.C. Aw, Clin. Chem. 1990, 36, 1657-1661.

44 a) U. Wollenberger, V. Bogdanovskaya, S. Bobrin, F. Scheller, M. Tarasevich, Anal. Lett. 1990, 23, 1795-1808;

    b) T. Tatsuma, T. Watanabe, T. Watanabe, J. Electroanal. Chem. 1993, 356, 245-253;

    c) P.C. Pandey, A.M. Kayastha, V. Pandey, Appl. Biochem. Biotechnol. 1992, 33, 139-144.

45 H. Gunashingham, C.-H. Tan, Anal. Chim. Acta1990, 229, 83-91.

46 I. Rosen-Margalit, A. Bettelheim, J. Rishpon, Anal. Chim. Acta 1993, 281, 327-333.

47 J. Kulys, H.E. Hansen, T. Buch-Rasmussen, J. Wang, M. Ozsoz, Anal. Chim. Acta 1994, 288, 193-196.

48 J. Kulys, L. Wang, H.E. Hansen, T. Buch-Rasmussen, J. Wang, M. Ozsoz, Electroanalysis 1995, 7, 92-94.

49 J. Wang, X. Zhang, M. Prakash, Anal. Chim. Acta1999, 395, 11-16.

50 G. Bremle, B. Persson, L. Gorton, Electroanalysis1991, 3, 77-86.

51 F. Tobalina, F. Pariente, L. Hernández, H.D. Abruña, E. Lorenzo, Anal. Chim. Acta 1999, 395, 17-26.

52 P.D. Hale, L.F. Liu, T.A. Skotheim, Electroanalysis 1991, 3, 751-756.

53 L.I. Boguslavsky, P.D. Hale, L. Geng, T.A. Skotheim, H.-S. Lee, Solid State Ionics 1993, 60, 189-197.

54 T. Ikeda, F. Matsushita, M. Senda, Biosens. Bioelectron. 1991, 6, 299-304.

55 M. Smolander, G. Marko-Varga, L. Gorton, Anal. Chim. Acta 1995, 303, 233-240.

 

Глава 6

Глава 8