4. Биокаталитические системы на основе электродов с ковалентно связанными медиаторами и ферментами в растворе

Электрический контакт растворенного фермента и медиатора электронного переноса, иммобилизованного на поверхности, интересен с точки зрения возможности протекания поверхностной ассоциации фермента и медиатора. Так, изучалась электрохимическая кинетика электродов, функционализированных различными медиаторами (виологены [1], производные фулерена C60 [2], микропероксидаза-11[3]) в сочетании с ферментами в растворе. В некоторых случаях электронный перенос на закрепленный медиатор происходил без образования ассоциатов (например, в случае золотого электрода, функционализированного монослоем C60  в контакте с растворенной глюкозооксидазой GOx (Рисунок 1A) [2]. На циклических вольтамперограммах появляется каталитический ток, свидетельствующий об эффективном переносе электрона в присутствии глюкозы и глюкозооксидазы (рис.1B) [2], величина которого пропорциональна концентрации глюкозы (рис.1B, вставка).

Рисунок 1: (A) Электрод, модифицированный монослоем фуллерена C60 , и его использование для биоэлектрокаталитического окисления глюкозы. (B) Циклические вольтамперограммы  на электроде, модифицированном C60 , в присутствии GOx (2 мг мл-1) и глюкозы в количестве (a) 0, (b) 20, (c) 40 и (d) 100 мМ. Измерения в 0.1 M фосфатном буферном растворе, pH 7.1, под аргоном, при скорости развертки 5 мВ с-1. Вставка: градуировочная кривая определения глюкозы

Однако кинетический анализ, проведенный в экспериментах с вращающимся дисковым электродом, модифицированным монослоем C60, показал отсутствие образования ассоциатов GOx и иммобилизованного медиатора. По всей видимости, взаимодействие фермента с поверхностью, модифицированной медиатором, протекает достаточно быстро и не ограничивает скорость биоэлектрокаталитического процесса. Если в качестве модификатора на поверхности электрода присутствует микропероксидаза-11 (MP-11) (3), ассоциация имеет место. MP-11 на поверхности электрода может переносить электроны в реакции с гемопротеинами, например, цитохромом с (Cyt c), миоглобином (Mb) и гемоглобином  (Hb)), образуя с ними аффинные комплексы на поверхности электрода [3]. Гем-содержащие монослои способствуют переносу электрона на цитохром-зависимые ферменты. Так, наблюдалось электрокаталитическое восстановление нитратов в присутствии растворенной цитохром-зависимой нитрат редуктазы (NR), контактирующей с монослоем MP-11 (рис.3A). Рис. 3B показывает циклические вольтамперограммы на электродах, модифицированных монослоем МР-11 в присутствии NR (кривая a) и после добавления нитрата (кривая b).

Рисунок 3: (A) Биоэлектрокаталитическое восстановление нитрата нитрат редуктазой на электродах, модифицированных монослоем МР-11. (B) Циклические вольтамперограммы на электроде, модифицированном MP-11 (a) в 0.05 M фосфатном буферном растворе, рН 7.0, (b) после добавления NR (24 mM) и  (c) после следующего добавления к тому же раствору KNO3 (5 мМ). Под аргоном, скорость развертки потенциала 5 мВ с-1.

 

В присутствии NR наблюдается электрокаталитический катодный ток, свидетельствующий о медиаторном электрохимическом восстановлении NR. Добавление к раствору NO3- приводит к значительному увеличению катодного тока вследствие электрохимического восстановления нитрата, катализируемого NR. Анализ в соответствии с кинетикой Михаэлиса-Ментен при варьировании концентрации нитрат-ионов свидетельствует об образовании комплексов между NR и MP-11 на поверхности электрода. Перенос электрона происходит в образовавшемся комплексе.

Поскольку описанные системы используют растворенные ферменты, их практическое значение невелико. Важным представляется вывод об образовании временных ассоциатов между ферментами и функционализированными поверхностями, например, при использовании монослоев МР-11. Такие ассоциаты могут быть использованы в интегрированных биокаталитических системах, состоящих из медиаторов и ферментов, закрепленных на поверхности преобразователя сигнала.

Литература к главе 4:
1 V.J. Razumas, A.V. Gudavicius, J.J. Kulys, J. Electroanal. Chem. 1986, 198, 81-87.
2 F. Patolsky, G. Tao, E. Katz, I. Willner, J. Electroanal. Chem. 1998, 454, 9-13.
3 A. Narvaez, E. Dominguez, I. Katakis, E. Katz, K.T. Ranjit, I. Ben-Dov, I. Willner, J.Electroanal. Chem.1997, 430, 217-233.

Глава 3

Глава 5