8. FAD-зависимые ферменты, контактирующие с кофактором, связанным с медиатором

 

Как отмечалось ранее, случайная функционализация основного костяка белка медиаторными группами приводит к образованию смеси продуктов, для которых с помощью электрохимических методов регистрируется некоторый усредненный сигнал. Чтобы достичь оптимального электрического контакта, необходимо добиться внедрения заместителя в определенное место, находящееся на оптимальном расстоянии от редокс-центра фермента. В случае ферментов, располагающихся на поверхности электрода, подобная функционализация обязана обеспечивать также определенную ориентацию системы фермент-медиатор относительно электрода. Эти требования относятся как к медиаторам, ковалентно связанным с кофактором фермента, так и к системам, в которых медиатор связан и с кофактором, и с электродом. Такое ориентированное ковалентное связывание медиатора позволяет добиться поведения иммобилизованного фермента, в целом аналогичного гомогенным условиям реакции.

 

Реконструкция ферментов из апофлавоэнзимов и ФАД, ковалентно связанных с медиатором

Новым способом обеспечения электрического контакта между редокс-центром фермента и его окружением является реконструкция фермента [1,2]. В соответствии с этим методом (рис.1(A)), активные центры глюкозооксидазы или оксидазы D-аминокислот, содержащие ФАД, удалялись из фермента с целью выделения апоферментов. Далее полусинтетический N6-(2-аминоэтил)-FAD (23), содержащий аминогруппы, ковалентно присоединялся  к (6-ферроценметиламино)гексановой кислоте (14) (рис.2), и далее бифункциональный кофактор FAD, содержащий ферроцен, соединялся с апоферментом глюкозооксидазы apo-GOx или оксидазы D-аминокислот apo-AOx. Полученные таким образом полусинтетические ферменты демонстрируют биоэлектрокаталитические свойства при окислении глюкозы или D-аланина, соответственно. Рисунок 1(B) показывает циклическую вольтамперограмму, полученную в растворе глюкозооксидазы, содержащей ФАД, функционализированный ферроценом, на электроде, модифицированном цистамином, в присутствии различных концентраций глюкозы. Градуировочный график, полученный на основе представленных вольтамперограмм, показан на рис.1(B, врезка). Биоэлектрокаталитические свойства таких "электроэнзимов" связаны с участием ферроцена в переносе электрона между FAD и поверхностью электрона.

Рисунок 1: (A) Изготовление модифицированного фермента методом реконструкции, включающим удаление нативного FAD из фермента (например, глюкозооксидазы GOx) и внедрение искусственного ферроцен-замещенного кофактора  в апофермент. (B) Циклические вольтамперограммы системы, содержащей глюкозооксидазу с ферроцен-замещенным FAD (1.75 мг/мл), при  различных концентрациях глюкозы: (a) 0, (b) 1, (c) 3 и (d) 20.5 мМ.

0.1 M фосфатный буферный раствор, pH 7.3, 35°C, золотой электрод, модифицированный цистамином, скорость развертки потенциала 2 мВ/с, под аргоном. Врезка: градуировочная зависимость биокаталитического тока, регистрируемого при 0.5 В отн. нас.к.э., от концентрации глюкозы.

 

Рисунок 2: Синтез пары ферроцен-FAD для реконструкции FAD-зависимых ферментов.

Поверхностная реконструкция ферментов из апо-флавоэнзимов на электродах, модифицированных FAD, содержащими медиаторы

Недавно было предложено проводить реконструкцию фермента непосредственно на поверхности, покрытой монослоем, содержащим FAD (рис.3(A)) [2,3]. Пирролохинолин пиррол (PQQ, 25) ковалентно пришивался к монослою цистамина, а N6-(2-аминоэтил)-FAD (23) присоединялся к монослою медиатора PQQ. Далее такой электрод, содержащий на поверхности систему PQQ-FAD, обрабатывался апоферментом apo-GOx. В результате поверхностная концентрация иммобилизованного биокатализатора достигала 1.7 10-12 моль/см-2. Сформированный таким образом реконструированный фермент демонстрировал  биоэлектрокаталитические свойства. Рис.3(B) показывает циклические вольтамперограммы, полученные на таком электроде в отсутствие и в присутствии глюкозы. В присутствии субстрата наблюдается электрокаталитический анодный ток, свидетельствующий о наличии электрического контакта между реконструированным ферментом и поверхностью электрода. Редокс-центр PQQ локализован на периферии белка и доступен для анодного окисления на электроде. Последующий медиаторный перенос электрона между PQQ и FAD обеспечивает биоэлектрокаталитическое окисление глюкозы. Генерируемый ток ограничен скоростью регенерации восстановленного FAD субстратом. Рис.3(B, врезка) показывает градуировочную кривую, полученную из амперометрического сигнала реконструированного фермента при различных концентрациях глюкозы. Достигаемая плотность тока необычно высока (300 мкА/см-2 при 80 мМ глюкозы). Контрольный эксперимент показал, что реконструированная глюкозооксидаза не способна к прямому электронному переносу с электрода, содержащего FAD, но не PQQ. Таким образом, медиатор (PQQ) является ключевым компонентом системы, ответственным за биоэлектрокаталитический процесс [2,3]. Число оборотов окислительно-восстановительной реакции глюкозооксидазы с участием молекулярного кислорода в качестве акцептора электронов составляет около 600 с-1 при 25°C. Используя значение энергии активации 7.2 ккал/моль, при 35°C оно должно составить 900 s-1 [2,3]. Плотно упакованный монослой глюкозооксидазы (около 1.7 10-12 моль см-2) при данном теоретическом значении числа оборотов должен генерировать ток порядка 300 мкА см-2. Это свидетельствует, что реконструированная глюкозооксидаза на монослое FAD-PQQ с точки зрения скорости переноса электрона столь же эффективна, что и исходный фермент в реакции с участием природного акцептора электронов (кислорода). Помимо высокой чувствительности представленного ферментного электрода, высокая эффективность электрического контакта может найти применение в создании других аналогичных ферментных сенсоров в будущем. Обычно амперометрические глюкозные сенсоры испытывают мешающее влияние окисляющихся примесей, таких как аскорбиновая или мочевая кислота. Кроме того, кислород может конкурировать с электродным процессом, участвуя в неэлектрохимическом окислении редокс-центра фермента. Эффективный электрический контакт биокатализатора с электродом может снять или уменьшить эти проблемы. В частности, как было показано, амперометрический сигнал электрода, модифицированного реконструированной глюкозооксидазой, при концентрации глюкозы 5 мМ не испытывал влияния со стороны растворенного кислорода и других мешающих примесей [2,3]. Высокая селективность и высокие плотности тока, достигнутые на таких электродах, позволяют, в частности, использовать их в качестве инвазивных глюкозных сенсоров. Чувствительность вполне позволяет конструировать микроэлектроды с компонентами, размещаемыми в кончике медицинской иглы. Они, несомненно, будут иметь в будущем хорошие перспективы клинического применения..

Рисунок 3: (A)  Поверхностная реконструкция фермента из апо-глюкозооксидазы на монослое PQQ-ФАД, сформированном на золотом электроде. (B) Циклические вольтамперограммы PQQ-FAD реконструированной глюкозооксидазы на золотом электроде (a) в отсутствие глюкозы и (b) в присутствии 80 мМ глюкозы. 0.1 М фосфатный буферный раствор, рН 7.0, под аргоном, при 35°C, скорость развертки 5 мВ с-1. Врезка: Градуировочная зависимость, полученная в хроноамперометрических измерения при E = 0.2 В отн. нас.к.э. на электроде, модифицированном глюкозооксидазой, модифицированной реконструированной глюкозооксидазой, содержащей PQQ-FAD при различных концентрациях глюкозы.

Важное значение для обеспечения электрической коммуникации между электродом и редокс-центром фермента имеет расположение промежуточного медиатора. Например, золотой электрод с монослоем PQQ был использован для реконструкции PQQ-зависимого фермента, глюкозодегидрогеназы [4]. В этом случае PQQ играет роль фиксированного кофактора, и поэтому он не может осуществлять функции медиатора между электродом и другим иммобилизованным кофактором. Электрохимическое окисление глюкозы таким реконструированным биокатализатором  становится возможным только при введении в систему дополнительного медиатора, диффузионно свободного (например, растворенного в растворе глюкозы). В других случаях, однако, определенная ориентация белка относительно электрода позволяет осуществиться электронному переносу вообще без участия медиатора. Комплекс Fe(III) и протопорфирина IX, полученный в монослое на золотом электроде, был использован далее для сборки с апо-миоглобином [5]. И хотя нативный миоглобин обычно не может участвовать в переносе электрона с электрода из-за глубокого расположения гема, миоглобин, реконструированный на поверхности, участвует в электрической коммуникации с электродом. Это объясняется близостью геминового центра к поверхности электрода за счет структурной реорганизации гемоглобина при его реконструкции.

 

Литература к главе 8:
1 A. Riklin, E. Katz, I. Willner, A. Stocker, A.F. Bückmann, Nature 1995, 376, 672-675.

2 E. Katz, A. Riklin, V. Heleg-Shabtai, I. Willner, A.F. Bückmann, Anal. Chim. Acta 1999,    385, 45-58

3 I. Willner, V. Heleg-Shabtai, R. Blonder, E. Katz, G. Tao, A.F. Bückmann, A. Heller, J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 10321-10322.

4 a) E. Katz, D.D. Schlereth, H.-L. Schmidt, A.J.J. Olsthoorn, J. Electroanal. Chem. 1994, 368, 165-171

   b) H.-L. Schmidt, W. Schuhmann, Biosens. Bioelectron.1996, 11, 127-135.

5 L.-H. Guo, G. McLendon, H. Razafitrimo, Y. Gao, J. Mater. Chem. 1996, 6, 369-374.

 

Глава 7

Глава 9