2. Прямой электронный перенос между ферментом и электродом

в отсутствие медиатора

 

Прямой электронный перенос между редокс-центром фермента и электродом обычно невозможен в силу изоляции активного центра белковой оболочкой. Тем не менее, предварительные исследования показали, что некоторые оксидоредуктазы могут электрически связываться с электродом, и этот процесс стимулирует биокаталитические превращения (рис.1) [1,2].  

Рисунок 1: Прямой электрический контакт электрода и фермента, находящегося на его поверхности.

Прямое электровосстановление H2O2 в присутствии пероксидазы из корней хрена  HRP (1) было показано в [3]. Сходную способность к прямой коммуникации с электродом показали и другие гем-содержащие пероксидазы - цитохром с пероксидаза [4], лактопероксидаза [5] и хлоропероксидаза [6]. Лакказа (медь содержащая полифенолоксидаза), как было найдено, может   катализировать электровосстановление молекулярного кислорода [7] (2).

Способность этих ферментов  к прямому электронному переносу связана с периферической локализацией их активных центров. Детальное кинетическое исследование [8] реакции восстановления Н2О2, катализируемого пероксидазой, показало, что 42% всех молекул фермента расположены на поверхности электрода таким образом, что гем-содержащий редокс-центр оказывается доступным для электронного переноса. Другие ферменты содержат два редокс-центра, так что электронный перенос происходит направленно от периферийного центра к внутреннему компоненту реакции. Например, метилгидроксилаза п-крезола содержит флавинадениндинуклеотид (ФАД) и гем, что обеспечивает окисление п-крезола до п-гидроксибензальдегида [9] (3).

Аналогично, цитохром c552 (Cyt c552, сульфид цитохром c оксидоредуктаза) содержит ФАД и две ковалентно связанные геминовые группы, осуществляющие биоэлектрокатализ окисления сульфида до серы [10] (4).

Прямой электронный перенос с участием ферментов этого класса обеспечил возможность их использования в биологических элементах распознавания. Так, сообщалось о детектировании  п-крезола [9], метиламина [11] и фруктозы [12] с помощью метилгидроксилазы п-крезола, метиламингидроксилазы и фруктозодегидрогеназы, соответственно.

Были также сконструированы сенсоры, включающие оксидоредуктазы, не способные к прямому переносу электрона на электрод. Такие ферменты используют молекулярный кислород в качестве акцептора электронов для окисления своих субстратов. Катехолоксидаза, оксидаза аминокислот, глюкозооксидаза, лактат оксидаза, пируват оксидаза, алкоголь оксидаза, ксантиноксидаза и холестерол оксидаза катализируют окисление соответствующих субстратов, сопровождаемое восстановлением  O2 до H2O2 (5).

И снижение концентрации кислорода, и увеличение концентрации пероксида водорода на поверхности электрода прямо пропорциональны концентрации субстрата в анализируемом образце. Это используется в амперометрическом определении субстратов.

Прямой электронный перенос между пероксидазой (HRP) и электродом позволяет проводить электровосстановление H2O2 в диапазоне потенциалов от  -0.2 до 0 В отн. нас.к.э. Такое сочетание с различными оксидазами также находит  применение в амперометрических биосенсорах (рис.2).

Рисунок 2: Использование пероксидазы HRP, электрически "связанной" с электродом, для определения Н2О2, образующегося в реакции первичного субстрата, катализируемой оксидоредуктазой.

Количество образующегося H2O2 определяется концентрацией субстрата, так что ток, протекающий в такой системе, может служить мерой количества определяемого вещества в пробе. Созданы амперометрические биосенсоры на основе HRP и следующих ферментов: глюкозооксидазы для определения глюкозы [13-17], алкоголь оксидазы для определения спирта  [18], холиноксидазы для определения холина [13], оксидазы аминокислот для определения аминокислот [19]. В качестве электропроводящего материала использовали графит [3], пиролитический графит [20] и платинизированные углеродные частицы [21], ферменты также включали в состав углеродных паст [22,23] или полипиррола [14,22]. На электрическую связь ферментов и электродов могут влиять также некоторые низкомолекулярные соединения, сами по себе электрохимически не активные, но включаемые в состав электродного вещества. Так, покрытие золотого, серебряного или платинового электрода монослоями таких промоторов позволяет получить обратимые электрохимические сигналы цитохрома с, содержащего частично открытый гем [24-26].  

Обычно такие промоторы связаны с электродом тиольными или дисульфидными группами и содержат структурные единицы, взаимодействующие с цитохромом с. Монослой модификатора препятствует прямому контакту белка и металлической поверхности электрода, что, в свою очередь, мешает необратимому разворачиванию глобулы фермента. В дополнение, взаимодействия между промотором и белком могут обеспечивать необходимое микроокружение белка, обеспечивающее требуемую короткую дистанцию переноса электрона - условие его эффективности. Наиболее распространенный промотор, активирующий электрохимические превращения цитохрома с - бис(4-пиридил)дисульфид [27], но эффективны также некоторые другие молекулы, содержащие тиольные и дисульфидные группы [28]. Аминокислоты и монослои олигопептидов также использовали для активации и цитохрома с [29], и некоторых других цитохромов [30]. Описано также применение в тех же целях  имидазола [31], тиофена [32] и иодида [33], осаждаемых на золотом или серебряном электродах. Цитохром с с таким электрическим контактом был использован для активации вторичных биокаталитических процессов с участием цитохром с зависимых ферментов (например, цитохром оксидазы, цитохром редуктазы, аскорбат оксидазы, лакказы и др.) [34,35]. Сходный подход был реализован в отношении других электрохимически активных белков и ферментов, таких, как аскорбат оксидаза из огурца, ферритин, медьсодержащие белки - азурин, псевдоазурин, умецианин, стеллацианин, плантацианин и пластоцианин [36] (рисунок 3)

4-Меркаптопиридин (и другие тиолы и дисульфиды) в виде монослоя на золотых электродах расширяют возможности электрохимии подобных белков/ферментов. Для переноса заряда с отрицательно заряженного ферредоксина с успехом был использован индиевый электрод, покрытый оксидом олова и модифицированный протонированным аминосилоксаном [37]. Вероятно, такие промоторы обеспечивают нужную для электронного переноса ориентацию белков на поверхности электрохимических преобразователей сигнала.

Прямая коммуникация между активным центром фермента и электродом достигается также благодаря особой наноморфологии поверхности электрода. Так, использование наночастиц металла может обеспечить достаточно близкий контакт активного центра, необходимый для реализации электронного переноса. Такая возможность в отношении цитохрома с была установлена при обработке электрода неагрегированными 12 нм частицами золота  [38]. Изменение размера частиц или использование коллоидного золота оказалось неэффективным. Электрический контакт через наночастицы золота используется и в конструкции биосенсоров. В одном из таких примеров для прямого переноса с участием пероксидазы использовали 30 нм частицы, в другом - комплекс D-фруктозодегидрогеназы и коллоидного золота включали непосредственно в состав углеродной пасты [40].

Если активный центр фермента глубоко спрятан в белковой глобуле, обычно прямой электронный перенос считается невозможным [41]. Тем не менее, в определенных строго подобранных условиях он наблюдается, например, для глюкозооксидазы на чистом золотом электроде [42] или в графитовой пасте [43]. Для таких необычных систем механизм реализации немедиаторного переноса остается не вполне понятным.

Другой способ влияния на прямой электронный перенос - сокращение расстояния переноса за счет использования низкомолекулярных фрагментов нативных биомолекул. Например, микропероксидаза-11 (MP-11) - гем-содержащий олигопептид, составляющий часть микроокружения активного центра цитохрома с [44] (рисунок 4). Поскольку активный центр  MP-11 недостаточно изолирован короткоцепочечным олигонуклеотидом, он способен прямо вступать в электрохимические реакции в водных [45] и неводных [46] растворах на немодифицированных электродах. Микропероксидаза-11 была также ковалентно иммобилизована на амино- [47] и карбоксифункционализированных [48] золотых электродах посредством связывания с ее амино- и карбоксильными группами, соответственно. Монослои MP-11 демонстрируют электрокаталитическую активность в восстановлении H2O2 [47] в водных растворах и органических перекисей - в неводных [49].

 

Литература к главе 2

Оглавление

Глава 3