3. Электронный перенос с участием свободных медиаторов

 

Электронный перенос с участием медиатора может протекать по диффузионному механизму (рис.1), в котором переносчик окисляется или восстанавливается на поверхности электрода.

Рисунок 1. Электрическая связь оксидоредуктазы посредством свободного медиатора, курсирующего между редокс-центром фермента и электродом.

Диффузионное проникновение окисленной или восстановленной формы медиатора в протеин создает достаточно короткую дистанцию для электронного переноса, достаточную для электроактивации биокатализа. Подход медиатора к активному центру внутри белковой матрицы контролируется гидрофильно-гидрофобными свойствами медиатора и фермента, размером и формой медиатора, а также электростатическими взаимодействиями между медиатором и ферментом. Медиатор может осуществлять электрический контакт в трех формах: в растворе, иммобилизованный в монослое (или мультислоях) на поверхности электрода или будучи включенным в пористую матрицу. Во всех этих случаях медиатор должен обеспечить свободный диффузионный перенос между проводящим материалом (обеспечивающим электрохимическую регенерацию медиатора) и молекулами фермента (биокатализатором).

 

Свободные медиаторы в паре с растворенными ферментами

Для обеспечения электрического контакта оксидоредуктаз с электродами используются производные ферроцена, органические красители, ферроцианиды, комплексы рутения и некоторые другие электрохимически активные соединения [1]. Циклическая вольтамперометрия позволяет оценить эффективность комбинации медиатор/фермент с использованием теории каталитических электрохимических процессов, а также рассчитать константы скорости второго порядка, характеризующие реакцию между ферментом и медиатором [2,3]. Растворимые оксидоредуктазы электрически могут быть связаны с различными свободными медиаторами, характеризующимися редокс-потенциалом (E0) и обеспечивающими различные значения константы скорости электронного переноса (ket, см.подробный обзор [1]). Сравнение эффективности электронного переноса с помощью  медиаторов и одного и того же фермента позволяет определить необходимые критерии электронного переноса. Такое исследование было, в частности, проведено для глюкозооксидазы (GOx) с различными искусственными акцепторами электронов - феназинметасульфатом, 2,6-дихлорфенолиндофенолом и N,N,N',N'-тетраметил-4- фенилендиамином [4]. Однако, все эти медиаторы имеют ряд ограничений, таких как низкая стабильность и рН-зависимость их редокс-потенциалов. Некоторые неорганические редокс-медиаторы, такие как гексацианоферрат [5], гексацианорутинат и пентааминопиридиниевый комплекс рутения [6] свободны от этих недостатков. Они имеют практически идеальное электрохимическое поведение и более стабильны, нежели органические красители. В качестве примера можно привести использование неорганических медиаторов совместно с рядом оксидаз, таких как саркозиноксидаза и лактатоксидаза [7]. В то же время, в случае неорганических медиаторов достаточно сложно регулировать их растворимость и электрохимические  свойства, поскольку они не могут быть модифицированы так же просто, как органические аналоги. Большинства этих недостатков лишены производные ферроцена, используемые как акцепторы электронов для растворимых оксидаз (например, глюкозооксидазы GOx). 

На рисунке представлены типичные вольтамперограммы ферроценмонокарбоновой кислоты (1) в присутствии растворенной глюкозооксидазы, для которой производное ферроцена выступает в качестве диффузионного медиатора электронного переноса. 

Рисунок 2: Циклические вольтамперограммы биоэлектрокаталитического окисления глюкозы в присутствии GOx (38 mM) и медиатора (1) (0.5 мМ) в присутствии (a) 0 мМ, (b) 0.5 мМ и (c) 2.5 мМ глюкозы. 0.085 M фосфатный буферный раствор, pH 7.0, под аргоном, скорость развертки потенциала 5 мВ с–1

Опубликованные значения [1] константы скорости второго порядка (ket) реакции восстановленного активного центра GOx (FADH2) и окисленной формы производного ферроцена варьируются от 0.26 105 до 5.25 105 М–1с–1. Не обнаружено простой корреляции между значениями ket и E0, однако, понятно, что положительно заряженные ферроцены способствуют переносу электрона с GOx [9]. Данный эффект связан с электростатическим взаимодействием положительно заряженной окисленной формы медиатора и отрицательно заряженной глобулой GOx. Сравнение эффективности переноса электрона между медиаторами и заряженными ферментами всегда требует учета электростатических взаимодействий [10]. Размер медиатора тоже имеет значение: как было показано, ферроцены, включенные в полость циклодекстрина, не способны принимать электрон с молекулы GOx [11]. Чтобы улучшить контакт медиатора и фермента, были также предложены мицеллярные системы на основе поверхностно-активных веществ, функционализированных производными ферроцена [12]. Глюкозооксидаза электрически контактирует с такими электрохимически активными мицеллами, что приводит к повышению эффективности переноса электрона на соответствующий редокс-центр медиатора.

 

Электроды с моно- и полислойным покрытием ферментами и медиаторы в растворе

Моно - и полислои оксидоредуктаз (таких как глюкозооксидаза [13] и биллирубин оксидаза [14]) получают на поверхности электрода с помощью бифункциональных реагентов, образующих ковалентные связи между слоями [13,14] или с помощью аффинных взаимодействий (например, авидин-биотин [15], рис.5, или антиген-антитело [16], рис.6).  Содержание фермента в монослоях мало, так что электрический контакт в присутствии растворенного медиатора обычно не приводит к появлению детектируемого амперометрического сигнала. Поэтому необходимо увеличение  концентрации фермента. Последовательное осаждение нескольких слоев увеличивает и содержание белка, и регистрируемый ток. Меняя число слоев, можно тонко регулировать величину амперометрического сигнала [17].  

Повысить содержание фермента в монослоях можно также путем увеличения шероховатости поверхности электрода (травления).Обработка золота ртутью приводит к увеличению шероховатости поверхности носителя фермента за счет образования и растворения амальгамы золота [18]. Если обычно поверхность золота имеет фактор шероховатости (roughness factor) 1.2-1.5, то после обработки он достигает 15-25.

 

 

Рисунок 7: Снимки поверхности травленого золотого электрода, сделанные с помощью электронного микроскопа (A и B - увеличение в 650 и 6500 раз, соответственно); для сравнения - поверхность гладкого золотого электрода (C - увеличение 6500)

Полислои GOx наносили на гладкую и травленую поверхности золотых электродов (рис.7) путем функционализации поверхности цистамином. В качестве диффузионного медиатора использовали ферроценмонокарбоновую кислоту [17].  Каталитические токи, полученные на гладких и травленых золотых электродах с четырьмя слоями  GOx, показаны на рис. 8A и B. Как видно, при использовании травленого электрода вместо гладкого токи биоэлектрокаталитического окисления глюкозы увеличиваются в  6 раз (рис. 8C).

 

Рисунок 8: Электрохимический сигнал золотых электродов с 4 слоями GOx с фактором шероховатости (A) 30 и (B) 1.2 в присутствии ферроценмонокарбоновой кислоты (290 mM) как диффузионного медиатора и глюкозы в концентрации (a) 0 мМ, (b) 6.8 мМ и (c) 36 мМ. (C) Градуировочные кривые глюкозы с использованием травленого (a) и гладкого (b) электродов. 0.1 M фосфатный буферный раствор, pH 7.3, 35°C, под аргоном, скорость развертки потенциала 2 мВ с–1.

 

Получение организованных полислоев ферментов открывает возможность сочетания двух и более ферментов в конструкции биосенсора [17]. Один из ферментов - оксидаза, электрически контактирующая с электродом посредством диффузионного медиатора. Другой фермент или ферменты превращают определяемое соединение в субстрат оксидазы. В результате регистрируемый ток переноса электрона пропорционален концентрации определяемого вещества. Примером такого подхода может служить биферментный электрод, включающий холиноксидазу (ChO) и холинэстеразу (AChE) [17]. Определяемое вещество - ацетилхолин - гидролизуется до холина в присутствии AChE, образующийся холин биоэлектрохимически окисляется в присутствии ChO до бетаина (рис.9). Медиатором последнего процесса служит 2,6-дихлорфенолиндофенол (2). Ток, генерируемый на биокаталитическом электроде, пропорционален концентрации первичного субстрата ацетилхолина.  В таблице 1 приведены примеры использования иммобилизованных ферментов в сочетании с диффузионными (находящимися в растворе) медиаторами электронного переносе.

 

Ферменты, иммобилизованные в олигомерные и неорганические матрицы в сочетании с медиаторами в растворе

Оксидазы могут также электрически связываться с проводящей основной, будучи включенными в электрополимеризованные пленки [19-23]. Одной из исходных посылок подобных исследований была попытка обеспечить прямой электронный перенос между ферментом и ферментом в электропроводящем полимере. Однако, как показали исследования, даже если прямой электронный перенос имеет место (например, при использовании полипиррола [23] ), эффективность его, как правило, невелика. Ее можно повысить, дополнительно используя для коммуникации диффузионный медиатор, обеспечивающий контакт между проводящим полимером (электродом) и ферментом. Так, с этой целью предложено использовать N-метил феназиний [19], бензохинон [19,24], гидрохинон сульфонат [25] и ферроценмонокарбоновую кислоту [21,22]. Обязательным условием функционирования подобных систем является пористость полимерного покрытия, чтобы медиатор мог проникнуть сквозь матрицу к активному центру фермента. Например, пероксидаза из корней хрена была сначала сорбирована на угольно-пастовом электроде и затем покрыта силикатом путем золь-гель иммобилизации. Полученный сенсор использовали для определения пероксида водорода в водной среде [26] и органических перекисей - в неводной [27]. Медиатором служили [Fe(CN)6]3- и ферроцены. соответственно. Добавляя новые ферменты к такому сенсору, удалось получить амперометрические сенсоры на глюкозу [28]  и фенолы [29]

Следует отметить, что все приведенные примеры используют низкомолекулярные медиаторы, которые легко вымываются из поверхностного ферментсодержащего слоя в объем раствора. Это существенное ограничение использования таких сенсоров, особенно in vivo. С практической точки зрения, следующим шагом должно было быть использование сходных принципов иммобилизации для медиаторов, обеспечивая таким образом возможность электронного переноса с участием связанных медиаторов недиффузионным путем.

 

Глава 2

Глава 4

Литература к главе 3