9. Медиаторный перенос электрона для NAD(P)+-зависимых ферментов

 

Никотинамидные кофакторы (NAD+ и NADP+) играют важную роль в биологических процессах электронного транспорта, выступая в качестве носителей протона или электрона. Первостепенное значение для функционирования живых систем имеет тот факт, что эти кофакторы распознают и вступают в быстрые реакции с определенными партнерами - NAD и  NADP+-зависимыми ферментами. В то же время,  отсутствуют побочные реакции с их участием, термодинамически возможные. Два никотинамидных кофактора - никотинамид аденин динуклеотид (NAD+ (26)) и никотинамид аденин динуклеотид фосфат (NADP+ (27)) имеют близкие структуры и электрохимические свойства. Их окисление-восстановление включает перенос двух электронов и протона (рис.1) и с формальной точки зрения может рассматриваться как перенос гидридного аниона.

В водных растворах при pH 7.0 термодинамический редокс-потенциал (E°) пар NAD+/NADH и NADP+/NADPH составляет -0.561 В и -0.565 В отн. нас.к.э., соответственно [1]. Электрохимическое поведение NAD(P)+/NAD(P)H изучалось на разных электродах (в том числе золоте, платине и стеклоуглероде). Как было показано, процессы его окисления/восстановления протекают в высшей степени необратимо и с большими перенапряжениями [2]. Дегидрогеназы, составляющие большинство оксидоредуктаз, используют NAD(P)+/NAD(P)H в качестве кофактора, так что электрохимическая регенерация его окисленной или восстановленной формы (NAD(P)+ or NAD(P)H) жизненно важны для обеспечения электрической коммуникации фермента и электрода. Принимая во внимание важность этого процесса, были разработаны специальные методы электрокаталитического окисления и восстановления NAD(P)+/NAD(P)H.

 

Электрохимическая регенерация NAD(P)+

 

Окисление NAD(P)H выглядит как перенос двух электронов, протекающий на немодифицированных электродах в одну стадию при значительных перенапряжениях  [3-5] (около 0.4, 0.7 и 1 В отн.нас.к.э. на углеродном, Pt и Au электродах, соответственно [6,7]), электролиз NAD(P)H в определенных условиях со 100% выходом дает NAD(P)+ [8]. Однако сильная адсорбция NAD(P)H и NAD(P)+ (например, на платине, золоте, стеклоуглероде и пиролитическом графите) обычно затрудняет окисление [6,7,9]. Более того, NAD(P)+ является ингибитором прямого окисления NAD(P)H [10], а сорбированный NAD(P)H может окисляться до нежелательных продуктов (по-видимому, димеров [4] и/или устойчивых аддуктов на поверхности  [11]). Процессы сорбции определяют различия в активности электродных материалов и влияние предобработки электродов на окисление NAD(P)H. Правильный подбор условий и материала электрода позволяет значительно снизить перенапряжение и облегчить окисление [12] (например, окисление NAD(P)H протекает на серебряном электроде при 0.23 В[13]). Специальная подготовка электрода (например, электрохимическое окисление поверхности) может уменьшить сорбцию NAD(P)H и увеличить выход NAD(P)+ [14,15]. Окислительная обработка стеклоуглерода приводит к образованию на его поверхности хиноидных групп, способных катализировать окисление NAD(P)H [15,16].

Для эффективного электроокисления NAD(P)H может использоваться медиаторный электрокатализ [3-5], с этой целью были изучены самые различные растворимые медиаторы [17-22]. Как было найдено, идеальными медиаторами окисления NAD(P)H выступают органические соединения, участвующие в окислительно-восстановительных реакциях с переносом двух электронов и одновременно выступающие как доноры/акцепторы протонов (например, орто- и пара-замещенные хиноны, фенилендиамины, аминофенолы), такую же роль могут играть и некоторые переносчики одного электрона (например, производные ферроцена [19,20]. Некоторые соединения демонстрируют очень высокие скорости окисления NAD(P)H в водных растворах [17,18,23,24]. 

Для регенерации NAD(P)+ использовали также медиаторы, иммобилизованные на электроде [3-5], такие как o-хиноны [11,22,24-27], п-хиноны [28], феназины, феноксазины и фенотиазины [29-31], комплексы Os [32], металлофталоцианины [33] и органические электропроводящие соли [34]. Для их иммобилизации использовали самые разнообразные методы Так, их сорбировали непосредственно на электроде [11,25,27,29], включали в полимерные пленки [26] или ковалентно пришивали к функциональным группам на поверхности электрода [22,24,30]. Большие перспективы имеет ковалентное присоединение редокс-медиаторов к самоорганизующимся слоям, образованными на золотых электродах. Таким образом, например, пирролохинолин хинон PQQ (25) был присоединен к аминогруппам слоя цистамина, собранного на поверхности золота (рис.2(A)). На таком электроде была получена высокая электрокаталитическая активность реакции окисления NAD(P)H, особенно в присутствии промотора - ионов Ca2+ [35] (рис.2(B)).  

 

NADP+-зависимая малатдегидрогеназа была ковалентно связана с золотым электродом, покрытым монослоем PQQ [36] (рис.3(A)). В присутствии NADP+ в качестве растворимого кофактора и яблочной кислоты в качестве субстрата (28) происходило биокаталитическое окисление 28 с образованием восстановленного кофактора, окислявшегося электрокаталитически на слое PQQ. Регистрируемый при этом ток определялся концентрацией NADPH, тогда как концентрация восстановленного кофактора - яблочной кислотой (рис.3(B)). Эту систему нельзя еще считать полностью интегрированной, но кофактор в ней является диффузионно свободным.

 

NAD(P)+-зависимые ферменты, находящиеся в электрохимическом контакте с электродом, обеспечивают высокую эффективность биоэлектрокаталитического окисления NAD(P)H. Например, для окисления NADH использовали диафоразу в сочетании с различными хинонами, флавинами или виологенами, играющими роль медиаторов электронного переноса между ферментом и электродом [37,38]. Бимолекулярные константы скорости для реакций переноса с участием медиаторов со значениями редокс-потенциалов, более положительными, чем -0.28 В отн. нас.к.э., могут достигать при pH 8.5 значений 108 M-1 с-1, что предполагает диффузионный контроль реакции. Высокая стабильность глюкозодегидрогеназы позволила осуществить биоэлектрокаталитическую регенерацию NAD(P)+ даже в препаративном масштабе [39].

Электрокаталитически регенерированный NAD(P)+ может сопрягаться с другим NAD(P)+-зависимым ферментом, что обеспечивает регенерацию кофактора в различных биотрансформациях [40,41]. Например, L-лактат таким способом был превращен в D-лактат с выходом, превышающим 97%. Для этого применяли L-лактатдегидрогеназу, использующую NAD+ , регенерируемый в электрокаталитической реакции [42]. Система включает стереоспецифичный катализ окисления L-лактата с электрохимической регенерацией NAD+ на аноде и электрохимическое восстановление пирувата на катоде.

Электрохимическая регенерация NAD(P)+ реализована в различных амперометрических биосенсорах, включающих NAD(P)+-зависимые гидрогеназы [41]. Например, биоэлектрокаталитическая регенерация NAD(P)+ с участием диафоразы была использована для обеспечения биокаталитического окисления метанола до CO2 в присутствии соответствующих NAD+-зависимых дегидрогеназ [38], соответствующие реакции проводились в анодном отделе топливного элемента на основе метанола и кислорода.

 

Электрохимическая регенерация NAD(P)H

 

Электрохимическое восстановление NAD(P)+ изучалось в водных [43-45] и неводных средах [46]. Процесс обычно протекает постадийно при очень отрицательных потенциалах (например, в водном растворе при pH 7.0 на ртутном электроде наблюдались две отдельные волны при -1.0 и -1.6 В отн. нас.к.э. [44]), т.е. процесс требует больших перенапряжений. Первая стадия включает одностадийное восстановление NAD(P)+ с образованием нейтрального радикала NAD(P)· (29), который переходит в неактивный для ферментов димер (30) [47]. Вторая стадия дает также неактивный продукт 1,6-восстановления (31) (рис.4(A)). В образующейся реакционной смеси обнаруживаются весьма незначительные количества активного в ферментативных реакциях продукта 1,4-восстановления NAD(P)H (32) , выход которого зависит от условий электролиза. Исходное состояние поверхности электролиза и величина начального фонового тока, как и налагаемый потенциал, в значительной степени определяют механизм восстановления NAD(P)+ и состав образующихся продуктов. Кинетика процесса зависит также от материала электрода, подбор которого в значительный степени улучшает эффективность электролиза. Так, гладкий серебряный электрод обеспечивает квазиобратимое восстановление-окисление NAD(P)+/NAD(P)H (катодный и анодный пики наблюдается соответственно при 0.12 и 0.23 В отн. нас.к.э. [13]). Тем не менее, NAD(P)H остается лишь побочным продуктом большинства некаталитических процессов, протекающих в электролизе на гладких электродах [3]. 

Рисунок 4: Схемы реакций электрохимического восстановления NAD(P)+: (A) в некаталитическом многостадийном процессе, (B) в присутствии катализатора.

 

Прямой безмедиаторный процесс электрохимического восстановления NAD(P)+ на модифицированных  электродах использовался для получения активного NAD(P)H и даже для сочетания регенерации NAD(P)H с некоторыми биокаталитическими реакциями [48]. Модификаторы, используемые в этих целях, электрохимической активностью не обладают и не участвуют в переносе электрона между электродом и NAD(P)+, однако они снижают требуемое перенапряжение и препятствуют образованию неактивных димеров [48]. Так, с этой целью предложено использовать золотой амальгамированный электрод, модифицированный холестеролом. На нем снижается скорость димеризации радикалов NAD [48]. Прямое электрохимическое восстановление NAD+ позволило осуществить ферментативное восстановление пирувата до D-лактата в присутствии лактат дегидрогеназы. Число оборота NAD+ составило около 1400. Образованию активного NAD(P)H способствуют также L-гистидин [49] и бензимидазол [50], иммобилизованные в монослое на поверхности серебряного электрода. Как видно на циклических вольтамперограммах, на модифицированных таким образом электродах протекает восстановление NAD+ до активной формы NADH при весьма низких перенапряжениях (-0.72 и  -0.03 В отн.нас.к.э. соответственно).

Электрокатализ регенерации NAD(P)H с помощью небиологических окислительно-восстановительных систем или NAD(P)+-зависимых ферментов значительно эффективнее, в том числе в плане снижения выходов неактивных побочных продуктов (рис.4(B)). Так, описано применение для электрокаталитического восстановления NAD(P)+ до NAD(P)H комплексов родия [51,52]. Они обеспечивают гомогенный катализ реакции с химической [53] и фотохимической [54-56] активацией. Электрокаталитический процесс включает региоселективный перенос двух электронов и протона на NAD(P)+. Предположительно, процесс идет с участием гидрид-родиевых интермедиатов. Для гомогенного переноса электрона на NAD(P)+ использовали трис(бипиридил)родий (III) [52,54], трис(5-сульфо-2,2'-бипиридил) родий (III) [56], (пентаметилциклопентадиенил-2,2'-бипиридил-хлороло) родий (III) [51,57] и хлоротрис[дифенил(м-сульфонатофенил)фосфин] родий(I) [55]. Каталитическая эффективность комплексов Rh изучалась в [58]. Было показано, что каталитическая активность уменьшается в присутствии электроноакцепторных заместителей в лиганде (2,2'-бипидиридил) и увеличивается электронодонорными заместителями. Заместители в положении 6 снижают эффективность катализа в силу стерических эффектов. Соотношение структура - реакционная способность было ислледовано также применительно к механизму региоселективного восстановления NAD+ комплексами Rh [59]. Рис.5 показывает циклические вольтамперограммы в присутствии растворенного катализатора ((пентаметилциклопентадиенил-2,2'-бипиридил-хлоро) родий (III)) и NAD+, их форма типична для электрокаталитических процессов [51]. Эти  примеры показывают возможность применения гомогенного катализа для переноса гидрид-иона на растворимый кофактор NAD(P)+.Гомогенное восстановление NADH с помощью комплексов родия использовалось в том числе для проведения биокаталитических реакций [51].

Рисунок 5: Циклические вольтамперограммы (пентаметилциклодиенил-2,2'- бипиридил-хлоро) родия (III) (a) в отсутствие и (b) в присутствии NAD+ в количестве 1:1. Скорость развертки потенциала 81 мВ с-1

 

Модификация электродов с помощью комплексов Rh, катализирующих перенос гидрида (т.е. восстановление NAD(P)+) значительно улучшает каталитическую регенерацию NAD(P)H [60-62]. Катализатор иммобилизуют на поверхности электрода, внедряя в полимерную пленку. С этой целью используются замещенные полипирролы, образующиеся в окислительной полимеризации соответствующих пиррол-содержащих лигандов. Иммобилизация комплексов родия в полимерных пленках достигается также в реакции обмена лигандов комплекса и полимера, содержащего лиганд [62]. Другой способ предполагает иммобилизацию сополимера гидрофильного N-винилпирролидона и комплексов родия, способных к полимеризации, например, (пентаметилциклопентадиенил-2,2'-бипиридил-хлоро) родия (III). Иммобилизация инициируется гамма-радиацией и дает высокопроницаемые пленки с высокой редокс-активностью [60]. Такие пленки легко набухают в воде, что обеспечивает необходимый для реакции объем. Этим данный способ выгодно отличается от использования поверхностно связанных комплексов родия. Сообщалось также о каталитической активности в реакции восстановления NAD+  поверхности электрода, модифицированного хиноидными остатками  [63].

Регенерация NAD(P)H с помощью медиатора, работающего в паре с ферментом, гарантирует, что восстановление NAD(P)+ протекает селективно и в результате образуется только активная форма NAD(P)H. Для биоэлектрокаталитического восстановления NAD(P)+ использовали многие ферменты, в том числе ферредоксин NADP+ редуктазу (FNR) [64-68], липоамиддегидрогеназу [69-72], форматдегидрогеназу [71,73], 2-оксалокарбоксилат редуктазу [74], эноатредуктазу [74,75], диафоразу [66,76-79], алкогольдегидрогеназу  [80] и диафоразу [81,82]. Для активации восстановительных ферментов использовали различные медиаторы, например, производные виологена [65,67-69,72,78,79], флавины [73,76,81], хиноны [66] или редокс-протеин ферредоксин [83]. Некоторые оксидоредуктазы могут непосредственно обмениваться электронами с электродом с регенерацией кофактора NAD(P)H. Например, гидрогеназы из Rhodococcus opacus и Atcaligenes eutrophus H16 успешно применялись для электрокаталитического восстановления NAD+ в отсутствие медиаторов [84]. Однако, электрокаталитическая эффективность таких ферментов обычно слишком мала для того, чтобы наблюдать каталитический ток на циклических вольтамперограммах (важное исключение - диметилфиологен (MV2+) / диафораза [72,78,79], MV2+/FNR [68] и ферредоксин/FNR [83]). Использование хиноидного медиатора адриамицина, работающего при низких потенциалах, для переноса электрона на диафоразу или FNR позволило повысить эффективность биоэлектрокатализа восстановления NADP+ с каталитическим током, наблюдаемым при потенциалах, более отрицательных чем -0.7 В отн.нас.к.э. (рис.6). Высокий выход по току (около 97%) был получен при использовании растворенной алкогольдегидрогеназы и ацетофенона в качестве медиатора [80].

Рисунок 6: Циклические вольтамперограммы биоэлектрокаталитического восстановления NADP+ на электроде, содержащем FNR (a) в присутствии адриамицина в качестве медиатора (60 мкМ) и (b) после дальнейшего добавления NADP+ (2.8 мМ). pH 7.0, скорость развертки потенциала 20 мВ с-1.

 

Иммобилизованные медиаторы, работающие при малых напряжениях (например, виологены) имеют ряд преимуществ по сравнению с медиаторами в растворе, когда речь идет о регенерации NAD(P)H с целью его включения в ферментативные реакции. Иммобилизация виологенов обычно приводит к положительному смещению редокс-потенциала [85]. К сожалению, при этом падает эффективность процесса. Смещение потенциала иммобилизованного виологена приводит к образованию димера и взаимодействиям с компонентами поверхностного слоя. Чтобы предотвратить сдвиг потенциала, предлагалась особая техника иммобилизации, состоящая в кросс-сшивке длинноцепочечных аминопроизводных виологена (33), FNR и бычьего сывороточного альбумина (BSA) глутаровым альдегидом на поверхности электрода. При этом высокая восстановительная способность виологена сохранялась [67]. Циклическая вольтамперограмма, полученная на электроде , модифицированном таким виологеном, FNR и BSA, в присутствии NADP+, демонстрирует большой электрокаталитический ток при потенциалах, более отрицательных, чем -0.45 В отн.нас.к.э. (рис.7). 

Рисунок 7: Циклические вольтамепрограммы, полученные на электроде, модифицированном FNR и (33), (а) в отсутствии NADP+ и (b) в присутствии 10 мМ NADP+. 50 мМ фосфатный буферный раствор, pH 8.0, 0.1 М KCl, скорость развертки потенциала 0.5 мВ с-1

 

Биоэлектрокаталитическая регенерация NAD(P)H с помощью соиммобилизованного виологена и диафоразы дает эффективность по току около 98% при -0.8 В отн.нас.к.э. [79]. Далее этот процесс был использован для амперометрического определения NAD(P)+[86]. При этом чувствительности по NAD+ и NADP+, составили 1.4 и 3.5 мА М-1 см-2 соответственно. Биоэлектрокаталитическое восстановление NAD(P)H может сопрягаться с NAD(P)+-зависимыми ферментами, использующими регенерированный NAD(P)H для восстановления специфических субстратов. Например, была показана возсможность восстановления ацетона до 2-пропанола при использовании алкоголь дегидрогеназы в сочетании с биокаталитической регенерацией  NADPH в присутствии MV2+ и FNR [80] (рис.8(A)).

Рисунок 8: Биоэлектрокаталитическое восстановление с использованием (A) алкогольдегидрогеназы для восстановления субстрата и FNR для регенерации NAD(P)H, (B) с использованием алкогольдегидрогеназы в обоих процессах, цикл Substrate 1/Product 1 обеспечивает медиатор для регенерации NAD(P)H, второй цикл дает конечный продукт  (Product 2).

NADH, регенерируемый гидрогеназой (из Alcaligenes eutrophus H16), контактирующей прямо с электродом, нашел применение для превращения a-кетоглутарата в L-глутамат в присутствии L-глутаматдегидрогеназы [87]. Число оборота составило 450 ч-1 и 207 ч-1 для тонкослойной электрохимической ячейки и препаративного электролиза в стационарном реакторе. Совместная иммобилизация двух ферментов, один из которых катализирует регенерацию NAD(P)H и второй - реакцию с использованием NAD(P)H, обеспечивает превращения веществ, требующие участия NAD(P)H, в одну стадию. Глутамат дегидрогеназа (GluDH) и FNR иммобилизовали на стеклоуглеродном электроде и исопльзовали для биокаталитического восстановления a-кетоглутарата и в присутствии растворенного NADP+ и адриамицина [66]. Рис.9, кривая с, показывает электрокаталитический ток, возникающий на таком электроде. Полное исчезновение анодного пика медиатора свидетельствует о его полной регенерации в процессе восстановления NAD(P)H.

Рисунок 9: Циклические вольтамперограммы биоэлектрокаталитического восстановления a-кетоглутарата на электроде, модифицированном FNR/GluD (a) в присутствии 31 мкМ адриамицина, (b) после добавления 84 мкМ NAD(P)+, и (c) после дальнейшего добавления 6.0 мМ a-кетоглутарата. 0.25 М NH4Cl, pH 8.5, скорость развертки потенциала 10 мВ с-1

 

В некоторых случаях единственный фермент (например, алкогольдегидрогеназа) может выполнять сразу обе функции - и регенерации NAD(P)H (в присутствии медиатора, обеспечивающего перенос электрона с электрода), и биокатализа (восстановления кетона до спирта [80]) (Рис.8(B)). При использовании биоэлектрокаталитической регенерации NAD(P)H  в сочетании со вторичными ферментативными реакциями был получен стереоселективный выход целевого продукта до 98% [88].

 

Ассоциация NAD(P)+-зависимых ферментов и кофакторов NAD(P)+ с помощью ковалентных связей и включения в матрицы

 

Ввиду высокой стоимости NAD(P)+/NAD(P)H, практическое использование  данного кофактора требует его иммобилизации совместно с ферментами. Ковалентное  связывание природных кофакторов NAD(P)+ в органической матрице приводит к значительному снижению их эффективности. Мобильность кофакторов жизненно важна для их эффективного взаимодействия с ферментом. Поэтому большое внимание уделяется синтезу искусственных аналогов  NAD(P)+ , в которых функциональные группы отделены от центра связывания специальными мостиками-спейсерами [89,90]. Спейсер обычно привязывают к положению N-6 молекулы NAD(P)+, он должен обеспечить определенную гибкость биоактивной части кофактора, достаточную для ассоциации с ферментом. Была изучены закономерности, связывающие структуру и активность искусственных аналогов NAD(P)+, также возможность их использования вместо натуральных кофакторов [89,91]. Производные NAD(P)+ (например, N6-аминоэтил-NAD+ (34)) ковалентно связывали с нерастворимой матрицей (например, сефарозой [92-94]) или водорастворимым полимером (декстран [95-98], полиэтиленимин [93,94,99], полилизин [93], полиэтиленгликоль [100-103]). В другой работе синтезировали производное NAD+ , несущее способные к полимеризации акриламидные группы. Далее его использовали для получения нерастворимого кофактора, проводя радикальную полимеризацию [104]. Все полимерные производные NAD(P)+ были испытаны на кофакторную активность и совместимость с ферментативными биокаталитическими процессами. Полимер-связанный кофактор NAD(P)+ ассоциировали с NAD(P)+-зависимыми ферментами, такими как алкогольдегидрогеназа [93,94,103,104], лактатдегидрогеназа [98,104], малатдегидрогеназа [100,104] и альдегид дегидрогеназа [99]. Как было установлено, различные полимеры, содержащие NAD(P)+, активны в сочетании с различными ферментами. Так, производные NAD+ с полиэтиленимином и полилизином сохраняли 60% и 25% активности природного кофактора NAD+ в присутствии лактатдегидрогеназы из мускульной ткани кролика и лишь 2-7% активности в присутствии аланиндегидрогеназы из Bacillus subtilis [93]. Сравнительное изучение активности кофакторов для различных ферментов весьма интересно. Хотя имеется несколько попыток предсказать соотношение структура-активность [91] для NAD(P)+, связанных с полимерами, большинство NAD(P)+-зависимых ферментов имеет неизвестную пространственную структуру, так что их совместимость с полимер-модифицированными кофакторами приходится определять экспериментально.

NAD+, связанный с полимером (альгиновой кислотой), иммобилизованный на поверхности, несмотря на большой молекулярный вес, показал высокую активность в переносе электрона в присутствии MV2+ и диафоразы. Это обеспечило регенерацию NADH для последующего сочетания с ферментами [105]. Предложен также безреагентный биосенсор на этанол, в котором использован коньюгат NAD+ и декстрана [96]. Смесь алкогольдегидрогеназы, NADH-оксидазы и коньюгата  NAD+-декстран внедряли в матрицу поливинилового спирта на поверхности электрода. В присутствии этанола алкогольдегидрогеназа восстанавливала NAD+ , связанный с полимером, до NADH. Последний, в свою очередь, окислялся NADH-оксидазой в присутствии кислорода. Это приводило к образованию исходного NAD+ , а также пероксида водорода H2O2 , который регистрировали на электроде (рис.10). 

Рисунок 10: Амперометрический сигнала биокаталитического электрода на введение этанола в концентрациях (a) 0.7 мкМ, (b) 1.4 мкМ и (c) 2.3 мкМ. Электрод включал алкогольдегидрогеназу, NAD+ в декстране и NADH-оксидазу. 0.1 М фосфатный буферный раствор, pH 8.5, 30°C, в присутствии кислорода. 

 

Систему можно улучшить, если вместо генерирования пероксида водорода использовать редокс-медиатор, связанный с NADH-оксидазой. Биокаталитические системы, в которых связанные с полимером производные NAD(P)+ объединены с соответствующими ферментами, нашли применение при создании ферментного реактора [101]. NAD+ , связанный с полиэтиленгликолем, был использован для непрерывного получения L-аминокислот из соответствующих a-кетокислот в реакции восстановительного стереоселективного аминирования [103]. (S)-1-Фенил-2-пропанол получали восстнавлением кетона в присутствии алкогольдегидрогеназы (из Rhodococcus erythropolis) и связанного с полимером NADH. Полное число оборота при этом достигало  8x104 [106].

Другой подход к сочетанию NAD(P)+ с ферментами предполагает ковалентное связывание функционализированного кофактора с основной цепью фермента [107-110]. Так, карбоксильные группы алкогольдегидрогеназы (остатки аспарагиновой и глутаминовой кислот) активировали карбодиимидом и N-гидроксисукцинимидом и далее вовлекали в реакцию с N6-N-(6-аминогексил)карбомоилметил]-NAD+ (35). В результате образовывался комплекс фермента и кофактора [107] (рис.11(A)).

Способ модификации, заключающийся в случайном присоединении NAD+, позволяет достичь средней нагрузки около 0.3-1.6 NAD+ на фермент. Для специфического связывания на поверхность глюкозодегидрогеназы внедряли остаток цистеина-44 с помощью направленного мутагенеза [111]. Синтетический аналог NAD+ далее ковалентно присоединяли к этому остатку за счет дисульфидного мостика (рис.11(B)). Комплекс фермент-NAD+ был активен, что может объясняться как активностью фермента в реакции с NAD+, присоединенным к тому же ферменту (внутримолекулярная активация), так и перекрестной реакцией между NAD+ и ферментом, принадлежащим к разным комплексам (межмолекулярная активация ). Возможность перекрестной реакции позволяет использовать два разных фермента с единицами NAD+, связанными только с одним из них (рис.11(C)). Смесь NAD+-функционализированной глюкозодегидрогеназы и нативной нефункционализированной лактатдегидрогеназы обеспечила протекание биокаталитического процесса с участием обоих ферментов, что дало L-лактат и глюконовую кислоту соответственно из пирувата и D-глюкозы [111].Число оборота составило 45 циклов в минуту на каждый NAD+ и порядка 1.35x105 в расчете на кофактор в целом в течение первых 2.5 дней (реактор на основе пустотелых волокон). Регенерацию NAD+ в этой системе проводили с помощью растворенного медиатора [110] или с помощью второго фермента, включающего NADH в другой ферментативный процесс [108].

Ковалентное сочетание производных NAD+, водорастворимых полимеров и ферментов объединяет оба подхода, описанных выше. Например, полиэтиленгликоль с ковалентно привязанными единицами  NAD+ активировали бифункциональным реагентом (36) и далее ковалентно привязывали к малатдегидрогеназе [100] или глюкозодегидрогеназе [102] (рис.12). 

Рисунок 12: Получение комплекса малатдегидрогеназы, полиэтиленгликоля и NAD

Внедрение NAD(P)+-зависимых ферментов в монослои, содержащие кофакторы NAD+ и редокс-медиаторы

 

Электроды, функционализированные монослоями с кофакторами ферментов (например, монослоями, содержащими NAD+) могут образовывать стабильные комплексы с соответствующими ферментами [112]. Такие поверхностные комплексы можно далее связывать для формирования интегрированных биоэлектрокаталитических устройств, содержащих одновременно медиаторы, кофакторы и  собственно ферменты. Так был получен электрический контакт с электродом NAD+-зависимых ферментов. Межмолекулярный комплекс между катализатором, монослоем NAD+ и ферментом был получен следующим образом [113]. Монослой PQQ ковалентно связывали с аминопроизводным NAD+, N6-(2-аминоэтил)-NAD+ (34) непосредственно на поверхности золотого электрода. Модифицированный таким образом электрод связывали с NAD+-зависимыми ферментами, такими как лактатдегидрогеназа или алкогольдегидрогеназа, за счет аффинных взаимодействий между кофактором и биокатализатором (рис.13(A)). Такие ферментные электроды катализируют окисление соответствующих субстратов (в данном случае молочной кислоты и этанола). Устойчивость активности невелика, примерно 25% комплексов диссоциирует в течение 30 мин, и фермент покидает поверхность электрода. Двумерное кросс-связывание ферментного слоя глутаровым альдегидом позволяет стабилизировать поверхностный слой, соответствующий сигнал полученного электрода в отсутствие (кривая а) и в присутствии (кривая b) молочной кислоты , а также соответствующие градуировочные зависимости  приведены на рис.13(B) для лактатдегидрогеназы. Система представляет собой полностью интегрированный биокаталитический процесс, в котором задействованы фермент, кофактор NAD+ и катализатор, присутствующие в одной матрице . Реакция между NAD+ и лактатдегидрогеназой представляет собой биохимическую часть цикла, ответственную за электрический сигнал, в то время как катализатор HQQ обеспечивает также электрохимическую регенерацию NAD+

 

Глава 8

Литература к главе 9

Глава 10