Электрохимические холинэстеразные сенсоры

 

Холинэстеразы (Кф 3.1.1.7 и Кф 3.1.1.8) широко применяются в составе электрохимических сенсоров, предназначенных для определения необратимых ингибиторов - фосфорорганических и карбаминатных пестицидов и ядов нервно-паралитического действия (зарин, зоман). Несомненно, мощным стимулом для данных исследований послужила в свое время потребность в быстрых и надежных способах определения боевых отравляющих веществ в полевых и лабораторных условиях. Анализаторы нервно-паралитических газов, принятые на вооружение армиями США и Великобритании, использовали электрохимические детекторы для определения активности холинэстераз. В Советском Союзе с той же целью использовали фотометрические системы детектирования сигнала. Начиная с середины 70-х годов, военные разработки стали использоваться в экологическом мониторинге, в том числе для непрерывного контроля содержания пестицидов антихолинэстеразного действия в воздухе и природных водах.

Начиная со второй половины 90-х годов, интерес к применению холинэстераз возрос в связи с потребностью определения ряда лекарственных препаратов, а также растительных токсинов (соланин и его метаболиты). Несмотря на осознание того факта, что холинэстераза не может обеспечить индивидуального определения пестицидов в силу низкой ингибиторной специфичности, исследования в области иммобилизации холинэстераз и создания биосенсоров продолжались. Неожиданно возродился интерес к холинэстеразам как средству обнаружения боевых отравляющих веществ. Угрозы химического терроризма, в частности, массовое отравление нервно-паралитическими газами в Токийском метро (дело секты "Аум Сенрике"), заставили вернуться к идее обобщенной оценки антихолинэстеразного действия суммы токсических веществ, присутствующих в пробе. Появились новые портативные приборы, рассчитанные, в том числе, для работы в автономном режиме. Один из таких приборов был разработан на кафедре химической энзимологии Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова. Новые приборы заметно превосходят предшественников 70-х по производительности и чувствительности сигнала. Для количественной оценки активности холинэстеразы и ее снижения при контакте с ингибиторами в них используется амперометрическое детектирование, выгодно отличающееся от потенциометрического линейным характером зависимости сигнал (ток) - концентрация субстрата (активность фермента). Это дает возможность снизить расход фермента. Последнее имеет большое значение, поскольку удельная активность иммобилизованного фермента непосредственно задает чувствительность определения ингибитора - чем  она меньше, тем ниже предел обнаружения отравляющего вещества или пестицида.

Другое важное направление развития холинэстеразных сенсоров - использование генетически модифицированных продуцентов, синтезирующих как "традиционные" белки, так и холинэстеразы с измененной пептидной последовательностью. Это позволяет решать ряд разнообразных задач, в том числе снижение себестоимости активных препаратов фермента, направленное изменение чувствительности модифицированных холинэстераз к определенным ингибиторам (фосфорорганическим и карбаминатным пестицидам), удобство иммобилизации с использованием специальных носителей. Например, введение гистидиновых фрагментов в концевой участок пептидной последовательности позволяет проводить иммобилизацию на силикагеле, модифицированном комплексом никеля (II), специфически связывающимся с гистидином. Аналогичный прием используется при иммобилизации олигонуклеотидов.

Учитывая, что чувствительность определения пестицидов определяется в основном константой бимолекулярного ингибирования, т.е. природой ингибитора и фермента, возможности совершенствования аналитических характеристик хиолнэстеразных сенсоров за счет оптимизации биохимического процесса на поверхности преобразователя сигнала можно считать почти исчерпанными. Поэтому основное внимание стали уделять пробоподготовке образца и концентрированию пестицида, в том числе непосредственно на поверхности биосенсора. Появляются серьезные аналитические исследования, в которых проводится подробный анализ достоверности и правильности определения пестицидов с использованием данных референсных методов (ВЭЖХ). Появляются работы по исследованию новых объектов анализа - таких, как детское питание или вино и продукты виноделия.

В заключение следует сказать и о ближайшем конкуренте холинэстераз. Это гидролаза органических эфиров фосфорных кислот, - гидролитический фермент, выделенный из некоторых микроорганизмов. Несмотря на то, что чувствительность определения фосфорорганических соединений с помощью данного фермента намного - на три порядка - ниже, а пределы обнаружения составляют 1-10 мкМ, интерес к нему не ослабевает. Дело в том, что холинсэтеразные сенсоры имеют принципиальное ограничение практического использования - после измерения ингибирования необходима стадия расщепления фосфорилированной хоилнэстеразы, т.е. восстановления исходной активности фермента (и сигнала биосенсора). А чем опаснее (токсичнее) ингибитор, тем прочнее он связывается с активным центром фермента. Поэтому приходится предусматривать периодический контроль остаточной активности препарата и его замены - автоматической или ручной. Гидролаза эфиров фосфорной кислоты использует пестициды как субстраты и не нуждается в такой реактивации, что делает биосенсоры на основе данного фермента намного удобнее в эксплуатации, особенно в автономном варианте.

 

Мы предлагаем вам краткое summary открытых публикаций по холинэстеразным биосенсорам. Для удобства они сведены в таблицы, в которых классифицируются по способу измерения активности холинэстеразы, способу иммобилизации фермента и по характеристикам определения ингибиторов. Отсутствие некоторых данных означает, что в публикации не содержатся сведения, позволяющие оценить соответствующих параметр.