Исследования холинэстераз получили импульс после определения аминокислотной последовательности в 1986 г. и расшифровки кристаллической структуры в 1991 г. В обоих случаях объектом исследования служила ацетилхолинэстераза из Torpedo californica. В качестве примера на рисунке приведена структура фермента, реконструированная по результатам рентгеноструктурного анализа.

 

Активный центр расположен почти в центре глобулы, в глубоком "ущелье". С одной стороны оно отделено от раствора полипептидной петлей С6794 , ограниченной дисульфидным мостиком между концевыми фрагментами и образующей монослой. 32% аминокислотных остатков внутренних стенок ущелья содержат ароматические кольца, участвующие в связывании субстрата. Непосредственно в разрыве эфирной связи в молекуле ацетилхолина участвуют три аминокислотных остатка - серин-200, гистидин-440 и глутамин-326, располагающиеся на дне "ущелья". Схематически это процесс изображен на рисунке.

 

Процесс протекает в три стадии.

На первом этапе молекула ацетилхолина втягивается в ущелье и закрепляется в активном центре благодаря взаимодействию OG атома гистидина и аммонийной группы. В этом процессе большую роль играют гидрофобные и электростатические взаимодействия. Показано, что ущелье представляет собой вытянутый диполь, ориентированный строго аксиально оси ущелья. Отрицательный потенциал увеличивается по мере углубления в ущелье, так что формируется своего рода электростатический "вакуумный насос", втягивающий положительно заряженную молекулу ацетилхолина благодаря скольжению вдоль ароматических колец, выстилающих стенки ущелья, на глубину до 20Å.

Электростатический потенциал диполя слабо зависит от ионной силы раствора до 0.01 М и величины рН вплоть до нейтрализации 7 кислотных остатков на поверхности глобулы около входа в ущелье, хотя эти факторы существенно изменяют общий дипольный и внешний электростатический потенциал над щелью.

На втором этапе происходит ковалентное связывание ацетилхолина по атому углерода карбоксильной группы к OG атому серина-200. Одновременно происходит перенос иона водорода из остатка серина-200 на атом NE2 гистидина-440. В результате образующийся на первом этапе тригональный комплекс Михаэлиса-Ментен переходит в более устойчивый тетрагональный комплекс.

На третьем этапе восстанавливается тригональная структура комплекса (образование ацилированной холинэстеразы) с одновременным высвобождением положительно заряженного холина. Механизм его выделения из активного центра против градиента электростатического потенциала остается неизвестным. На основании динамического моделирования предложен механизм выхода холина в противоположную от входа в "ущелье" сторону, возможно, через тонкую монослойную стенку ущелья. Правда, остается неясным, как удается избежать энергетических потерь на необходимую для этого значительную конформационную перестройку белка.

Традиционная точка зрения предполагала наличие локализованного второго участка активного центра, координирующего холиновую часть субстрата ("анионная поверхность"), который по данным исследования ингибирующей способности бис-кватер-низированных азоторганических соединений должен располагаться на расстоянии около 14 Å от активного центра. Позднее было показано, что в молекуле фермента нет различимой "анионной поверхности", кватернизированный атом азота холина координируется за счет гидрофобных взаимодействий с p-электронами остатка триптофана-84.

Холинэстеразы из различных источников отличаются удивительной близостью строения. Так, ацетилхолинэстераза из Torpedo Californica и бутирилхолинэстераза сыворотки крови человека идентичны по аминокислотной последовательности на 53%, по аминокислотному составу - на 73%, причем совпадающая часть полипептидной цепи приходится в основном на N-концевой фрагмент, где полностью идентичны 535 аминокислотных остатков. В одних и тех же местах располагаются также дисульфидные мостики (67-94, 254-265, 402-521). Субстратная специфичность холинэстераз определяется траекторией перемещения субстрата в ущелье и, возможно, природой 14 аминокислотных остатков, формирующих "дно ущелья".

Не совсем ясным остается биохимическое назначение бутирилхолинэстеразы. Безусловно, она является резервным ферментом, восполняя недостаток ацетилхолинэстеразы в экстремальных условиях. В то же время, около 7% населения (в основном в Юго-Восточной Азии) имеет аномально низкий уровень активности бутирилхолинэстеразы. Причина состоит в генетической мутации, в результате которой один остаток аспартата в аминокислотной последовательности бутирилхолинэстеразы меняется на глициновый. Тем не менее, низкая активность бутирилхолинэстеразы не приводит к снижению жизнеспособности человека даже в младенческом возрасте. По некоторым предположениям, бутирилхолинэстераза осуществляет скэведжинговые функции, т.е. расщепляет остатки органических макромолекул, накапливающиеся в процессе жизнедеятельности Не исключено участие бутирилхолинэстеразы в процессах детоксикации. Среди других нехолинэргических функций холинэстераз тмечается фосфатазная активность.