"Методы групповой оценки загрязнителей окружающей среды на основе биохимических тестов и биосенсоров"

Аннотационный отчет

В соответствии с программой исследований в 1998-2000 гг. были проведены исследования по возможности обобщенной оценки загрязнения различных объектов окружающей среды с помощью биохимических диагностикумов и биосенсоров и современных средств методов математической классификации на основе традиционных статистических (дискриминантный анализ) и нетрадиционных (нейросетевых) методов. В работе использовали стабилизированные препараты бутирилхолинэстеразы из сыворотки крови лошади, включенные в состав фотоколориметрических и электрохимических биосенсорных устройств. С их помощью оценивалось ингибирующее действие совокупности загрязнителей окружающей среды на свободный и иммобилизованный фермент. Помимо антихолинэстеразной активности измеряли обобщенные гидрохимические (БПК, ХПК) и токсикологические показатели (острая токсичность для равноресничных инфузорий Paramecium caudatum и ветвистоусых рачков  Daphnia magna Beyer). В качестве объектов исследования использовали модельные растворы токсикантов, реальные образцы сточных вод промышленных и сельскохозяйственных предприятий, водные и органические экстракты из осадков сточных вод и почв. Всего за три года было исследовано более 400 проб. Исследования проводились в три этапа:

1. Определены кинетические параметры ингибирования нативной холинэстеразы из различных источников и аналитические характеристики определения приоритетных токсикантов с помощью иммобилизованного фермента в различных условиях измерения сигнала и инкубирования. На модельных растворах ингибиторов (соли тяжелых металлов, фосфорорганические и карбаминатные пестициды, поверхностно-активные вещества, азоторганические соединения, фториды) проведена сравнительная оценка чувствительности ферментативных методов анализа и принятых в экоаналитическом контроле методов биотестирования. Произведен скрининг антихолинэстеразной активности первичной выборки сточных вод промышленных предприятий (250 проб вод), произведена первичная оценка соотношения показателей токсичности и антихолинэстеразной активности. По результатам исследования холинэстеразные сенсоры на основе плоских стеклянных рН-метрических электродов (производство Санкт-Петербургского университета) и бумажных ферментсодержащих мембран переданы в Центральную специализированную инспекцию аналитического контроля Минприроды РТ (г.Казань).

2. На основании первичной оценки результатов скрининга предложена система классификации сточных вод по преимущественному токсическому действию (источнику загрязнения). В соответствии с ней для последующей математической классификации были выделены три класса сточных вод, соответствующие преимущественному загрязнению тяжелыми металлами, устойчивыми органическими загрязнениями и неустойчивыми органическими загрязнениями и биогенными элементами. Отнесение 175 проб контрольной выборки к тому или иному классу проводилось путем  анализа экологических паспортов предприятий-водопользователя, в спорных случаях привлекалось мнение экспертов – сотрудников ЦСИАК Минприроды РТ и Горводоканала. Была построена система экспертной оценки загрязнения (класса сточных вод) по системе независимых параметров, включающие химическое и биохимическое потребление кислорода, смертности инфузорий Paramecium caudatum и антихолинэстеразной активности проб до и после их электрохимического окисления. Процедура окисления была предложена для моделирования процессов деградации токсикантов в окружающей среде.  

Для математической классификации в рамках предложенной экспертной системы использовались дискриминантный анализ и нейронные сети прямого распространения и построенные на теории адаптивного резонанса (Fuzzy ART Map). Линейные регрессионные методы не позволяют проводить дискриминацию данных даже при объединении 2 и 3 класса сточных вод (органическое загрязнение), загрязнение вод тяжелыми металлами выделяется с  вероятностью, незначительно превышающей априорную (частоту встречаемости данного класса в контрольной выборке).

Наилучшие результаты показывает применение нейронных сетей прямого распространения, состоящей из двух невидимых слоев из 5 и 7 нейронов, соответственно. Для полной выборки (обучение и дискриминация на одном и том же наборе из 175 проб вод) успешный прогноз класса (характера загрязнения) получен в 70% случаев, в том числе для вод, загрязненных тяжелыми металлами, - более чем в 80% случаев.

Выделение контрольной выборки (оценка прогнозных свойств классификаторов) их общего числа проб сокращает вероятность успешного прогноза, полученной с помощью нейронных сетей прямого распространения, на 7-12%. Преимущество получает  сеть Fuzzy ART Map, для которой  на лучших генерированных обучающих выборках распределение проб в контрольной выборке прогнозируется с 85% успехом. Для нейронных сетей прямого распространения данный показатель составил 65-70% ( в зависимости от генерированной обучающей выборки). Изучено влияние способа генерирования контрольной выборки, последовательности подачи элементов обучающей выборки на входные нейроны сети и параметров обучения (скорость обучения и vigilance в методе Fuzzy ART Map) на число генерированных кластеров и успешность прогноза класса вод.

3.  Проведена оценка загрязнения почв и сточных вод подвижными формами тяжелых металлов. Установлена зависимость между существующей системой классификации токсичности твердых промышленных отходов (классы опасности) и максимально допустимых уровней содержания токсикантов в почвах и растительной продукции и ингибирующим действием экстрактов на холинэстеразные биосенсорные устройства. Как показали результаты тестирования, ингибирующее действие экстрактов не коррелирует ни с содержанием тяжелых металлов, ни с показателями биотестирования, поскольку определяется не только и не столько содержанием подвижных форм металлов, сколько процессами комплексообразования с участием органических кислот, экстрагируемых из пробы. Так, водные экстракты из почв и осадков сточных вод не ингибируют холинэстеразу независимо от содержания тяжелых металлов, кислотные и солевых экстракты оказывают ингибирующее действие, а органические (ацетон) – активируют фермент за счет протекания обменных процессов с высвобождением ионов кальция – природного эффектора фермента. Те же экстракты оказывают токсическое действие на тест-организмы даже при разбавлении в 10-1000 раз.

Предложена система относительной оценки токсичности осадков сточных вод и других объектов, загрязненных тяжелыми металлами, основанная на сочетании приемов пробоподготовки и различных средств биохимической диагностики. Для этого предлагается использовать не абсолютные значения ингибирующего эффекта, а их изменения, наблюдающиеся при переходе от водного к кислотному и органическому экстрактам. Кроме того, как и для сточных вод, предлагается проводить электрохимическое окисление экстрактов с целью разрушения органических комплексов металлов и увеличения количества экстрагируемых форм металлов. Как показывали эксперименты, проведенные с осадками различного срока хранения с очистных сооружений г.Казани и Альметьевска, относительное изменение ингибирующего действия осадков коррелирует с общим содержанием в осадках наиболее подвижных металлов, а для осадков длительного срока хранения (8 лет и более) – с суммарным содержанием тяжелых металлов, определенным методом атомно-абсорбционной спектроскопии. Обсуждаются причины гиперчувствительности инфузорий к действию экстрактов из осадков сточных вод и низкая чувствительностью холинэстеразных биосенсоров к действию почвенных экстрактов.