ГРАНТ РФФИ 06-03-32217-а

"Графитовые электроды, модифицированные наноструктурированным полианилином, как преобразователи сигнала в химических и биохимических сенсорах"

 

РАЗВЕРНУТЫЙ НАУЧНЫЙ ОТЧЕТ ЗА 2008 г.

 

Полученные за отчетный период важнейшие результаты:
Проведено комплексное исследование условий получения модифицирующих слоев на основе углеродных нанотрубок (УНТ) с включением моно- и полимерных форм фенотиазиновых красителей (метиленовый синий, метиленовый зеленый, тионин, толуидиновый синий) и нативной ДНК и олигонуклеотидов (аптамеры для определения тромбина). Исследование включало установление рабочих условий нанесения УНТ, обеспечивающих их высокую адгезию к электроду и проницаемость для низкомолекулярных носителей заряда, оценку воспроизводимости основных электрохимических характеристик и совместимости с биополимерами; отработку условий электрополимеризации указанных медиаторов на поверхности УНТ или их сорбционного удерживания в слое УНТ, сравнительную характеристику полислойных покрытий с участием УНТ, медиаторов и ДНК с точки зрения влияния отдельных компонентов на процессы переноса заряда и редокс-активность медиаторов.  Установлено, что определяющими факторами, от которых зависят свойства полислойного покрытия, являются удельная плотность нанесения УНТ и способ их предварительной подготовки. Наилучшие результаты показало окисление УНТ смесью серной и азотной кислотой с последующим ультразвуковым диспергированием. Оптимальное количество УНТ составило 2-20 мкг/см2. Меньшее количество УНТ не обеспечивало полного заполнения поверхности электрода, а большее приводило к значительной неоднородности слоя, а также к частичному отслоению покрытия в процессе последующего нанесения биологических компонентов. Продолжительность ультразвукового диспергирования не влияла на характеристики модифицированных УНТ электродов, но в существенной мере определяла устойчивость дисперсии УНТ при ее последующем хранении. Оптимальным растворителем для получения дисперсий является ДМФА, однако менее устойчивые системы можно получить, проводя диспергирование в соляной кислоте, ДМСО и пропиленкарбонате. Попытки стабилизации пленок растворами ПАВ показали, что неионные и анионные ПАВ (Тритон-Х-100, ПЭГ-10000, додецилсульфат натрия) в значительной степени повышают устойчивость дисперсий ДНК, однако полностью блокируют сорбционное удерживание мономерных форм фенотиазиновых красителей и резко снижают эффективность полимеризации фенотиазинов на электродах, модифицированных УНТ. Важным условием получения воспроизводимых характеристик покрытий явилась обработка электродов после закрепления на них УНТ. Помимо отмывки и кондиционирования в рабочем буферном растворе или электролите, в последующем применяемом для полимеризации фенотиазинов, признано необходимым кратковременное прокаливание модифицированных УНТ электродов при 120-150оС. Перед прокаливанием необходимо полное высушивание электродов в токе воздуха, поскольку остаточные количества ДМФА могут реагировать с фенотиазинами, что приводит к снижению электропроводности поверхностного слоя и его проницаемости для низкомолекулярных электрохимически активных соединений
– маркеров процессов с участием ДНК. Прокаливание позволяет существенно повысить устойчивость слоя УНТ в процессе последующей обработки электродов, хотя и снижает однородность покрытия в силу краевых эффектов (стягивание пленки УНТ на границе стеклоуглерод – тефлон). При использовании для нанесения раствора УНТ, содержащего фенотиазиновые красители, температуру прокаливания следует снизить, поскольку взаимодействие фенотиазинов с остаточными количествами ДМФА приводит к резкому снижению электропроводности получаемого слоя, возможно, в результате их взаимодействия и реакции поликонденсации ДМФА. При использовании в качестве диспергатора соляной кислоты последующее прокаливание не приводит к значимому изменению устойчивости покрытия, что, возможно, связано с тем, что в данных условиях размер агрегатов УНТ больше, нежели в ДМФА. Об этом же свидетельствует седиментационная неустойчивость дисперсии УНТ в ДМФА. 


Изучение возможности одновременного нанесения УНТ и фенотиазинов в одну стадию путем добавления красителя в дисперсию УНТ в органическом растворителе показало следующее. По сравнению с послойным нанесением (осаждение УНТ из органического растворителя – высушивание – инкубирование в растворе фенотиазина) происходит существенное улучшение воспроизводимости и устойчивости образующегося покрытия. В частности, увеличиваются токи пика окисления-восстановления фенотиазинов, остающиеся неизменными в течение, по крайней мере, 8 часов непрерывного нахождения в рабочем буферном растворе (не менее 150 циклов измерения – отмывки). В процессе эксплуатации величина токов пика и их положение на вольтамперограммах практически не меняются, что говорит о высокой прочности удерживания фенотиазинов в слое УНТ. С другой стороны, введение фенотиазинов в дисперсию УНТ резко снижает ее седиментационную устойчивость: раствор следует использовать немедленно, при хранении происходит выпадение фракции УНТ – фенотиазин, которая не способна к повторному диспергированию в ультразвуковой ванне. О включении фенотиазинов в выпадающий осадок свидетельствуют изменение цвета осадка и раствора, а также наблюдение пиков фенотиазинов после включения дисперсии осадка в угольную пасту. Также снижается химическая устойчивость дисперсии. В частности, при хранении дисперсии УНТ – фенотиазина в ДМФА в течение ночи происходит расслаивание раствора, при нанесении его на электрод происходит быстрое желирование и образуется эластичная пленка, обладающая низкой электропроводностью и не дающая на вольтамперограммах характеристических пиков окисления-восстановления фенотиазинов. Процесс более выражен при использовании метиленового синего, но в меньшей степени протекает и для других изученных фенотиазинов. 


Исследование электрополимеризации анилина и фенотиазиновых красителей на поверхности электродов, модифицированных УНТ, проводили с использованием постояннотоковой вольтамперометрии по характеристическим пикам окисления-восстановления маркеров – феррицианида, гидрохинона и метиленового синего. Выбор маркеров обусловлен их различным зарядом и склонностью к реакциям с полимерными покрытиями и ДНК, а также потенциальной возможностью образования обратимой редокс-пары в элементарных стадиях. Кроме того, измеряли электрохимический импеданс пленки в присутствии редокс-маркера – эквимолярной смеси феррицианидов (II) и (III). Показано, что при нанесении фенотиазинов в смеси с ДНК процессы полимеризации полностью подавляются. При варьировании пределов сканирования потенциала происходит незначительное изменение высоты пиков при сохранении их положения на шкале потенциалов, что можно связать с электростатическим удалением наименее связанной фракции красителя. Ни увеличения пиков, ни их смещения в сторону более анодных потенциалов, что является признаком процесса полимеризации, при этом не наблюдалось. При проведении сканирования потенциала электрода, модифицированного УНТ, в растворе фенотиазинового красителя, в случае метиленового синего происходил процесс полимеризации аналогично реакции на чистом немодифицированном стеклоуглероде. Наблюдались пики образования первичного катион-радикала при высоких анодных потенциалах (более 800 мВ), а также образование второй пары пиков, смещенной относительно сигнала мономера к более анодным потенциалам. Характер изменений зависит от удельной концентрации УНТ. В области малых заполнений (до 2 мкг/см2) общие изменения вольтамперограмм на гладком и модифицированном УНТ электроде практически совпадали. При увеличении толщины слоя УНТ (2-20 мкг) изменения приобретают скачкообразный характер. В первых десяти циклах полимеризации наблюдается закономерное увеличение токов окисления-восстановления пиков мономерной и полимерной форм метиленового синего, сопровождаемое снижением сопротивления переноса заряда и незначительным увеличением емкости поверхностного слоя. После этого происходит резкое снижение регистрируемых токов и увеличение параметров сопротивления и емкости слоя. Дальнейшее увеличение числа циклов сканирования потенциала показало постепенное возвращение указанных параметров к исходным значениям. По-видимому, наблюдаемые изменения связаны с заполнением поверхности УНТ или чистого стеклоуглерода продуктами полимеризации фенотиазина, после чего происходит резкое сокращение истинной площади поверхности электрода и / или электропроводности вновь образующейся поверхности полимерного метиленового синего. При попытках проведения полимеризации метиленового зеленого установлено, что при увеличении числа циклов сканирования более 30 происходит практически полное блокирование поверхности электрода, сопровождаемое резким снижением регистрируемых токов и почти десятикратным увеличением сопротивления переноса заряда через поверхностный слой. Эффективность полимеризации метиленового зеленого значительно уступает характеристике того же процесса на гладком стеклоуглероде, а также полимеризации метиленового синего, что, возможно, связано с меньшей склонностью данного фенотиазина к окислительной полимеризации и побочными процессами в олигомерных продуктах, нарушающих их окислительно-восстановительные процессы. Подавляется образование первичного катион-радикала, а также практически полностью исчезает способность к электростатической аккумуляции ДНК и олигонуклеотидов. Исследование поведения маркеров показало, что в случае нейтрального гидрохинона регистрируемый ток окисления полностью определяется диффузионным переносом маркера через полимерный слой. С увеличением числа циклов сканирования потенциала в растворе метиленового синего и метиленового зеленого происходит снижение тока окисления гидрохинона. Изменение толщины полимерного слоя и его проницаемости происходит практически монотонно вплоть до 60 циклов. Не обнаружено участия поли(метиленового синего) и поли(метиленового зеленого) в медиаторном переносе электрона с гидрохинона. В случае феррицианида ток его окисления определяется преимущественно электростатическим накоплением маркера на положительно заряженном слое электрополимеризованного фенотиазина. При этом в течение первых 10 циклов сканирования потенциала накопление носит регулярный и практически линейных характер, после чего скорость электростатической аккумуляции резко снижается, и сигнал выходит на предел после 30 циклов полимеризации. Окисление-восстановление метиленового синего осложняется его сорбционным накоплением независимо от заряда и степени окисления полимерной пленки. Это в значительной степени снижает воспроизводимость сигналов. Сигнал метиленового синего на поли(метиленовом зеленом) при числе циклов сканирования потенциала более 20 практически не зависит от дальнейшего увеличения толщины пленки и по потенциалу смещен относительно аналогичных пиков на гладком стеклоуглероде на 150-200 мВ в сторону более анодных значений.


Наблюдаемые изменения характеристик полимерных пленок фенотиазиновых красителей, получаемых поверх УНТ, можно объяснить следующим образом. В области малых заполнений поверхности электрода (до 10 циклов сканирования) остаются свободными участки поверхности УНТ или стеклоуглерода, в результате чего последующие электрохимические реакции маркеров или мономеров фенотиазинов протекают как поверх слоя полимера, так и на свободных участках. При этом перенапряжение окисления фенотиазинов практически не меняется, а изменение токов связано с изменением соотношения свободных / занятых участков поверхности. При увеличении циклов сканирования до 30-60 вся поверхность электрода закрывается полимером. Пики, относимые к мономерным формам красителей, связаны с превращениями молекул, захваченных в слой полимера, о чем говорит линейная зависимость тока пика от скорости сканирования потенциала и сохранение пиков при переносе электрода в буферный раствор, не содержащий исходного фенотиазина. В этом случае природа поверхности электрода при увеличении числа циклов сканирования остается неизменной, а изменение токов связано с удельной поверхностью полимерной пленки, которая может уменьшаться при заполнении пор УНТ и далее увеличиваться за счет собственной шероховатости образующейся пленки. В случае поли(метиленового зеленого) электроактивность полимера остается низкой, поскольку и мономер, и полимер демонстрируют низкую склонность к медиаторному переносу электрона. 


Проведение исследования полимеризации фенотиазинов на поверхности электродов, модифицированных УНТ, показало, что условия последующей иммобилизации ДНК и олигонуклеотидов при изменении числа циклов сканирования потенциала могут существенно варьировать за счет изменения природы подложки (смешанная поверхность УНТ – полифенотиазин на малом числе циклов и полимер – на большом), электростатических взаимодействий, а также, возможно, стерических факторов, обусловленных резким изменением шероховатости поверхности. Попытки совместной полимеризации анилина и фенотиазинов на электроде, модифицированном УНТ, показало, что поведение указанных соединений в целом не отличается от такового на гладком стеклоуглероде. Вклад УНТ может быть объяснен исключительно увеличением истинной поверхности рабочего электрода. Наблюдалось значительное – до 50 раз – увеличение токов пика эмералдин сульфата и анилинового черного при полимеризации анилина в серной кислоте. Полимеризация поверх слоя полианилина метиленового синего не приводила к значимому изменению вида вольтамперограмм за исключением резкого – до 2-3 раз – увеличения пиков первой сопряженной пары, относимой к окислению-восстановлению эмералдин сульфата. Это может быть связано с совместным окислением мономерной формы метиленового синего и эмералдина, которые по отдельности протекают в близкой области потенциалов. Также происходит наложение пиков в области накопления полимерной формы поли(метиленового синего) и хиноидных структур, образующихся при окислительной деструкции полианилина. 


Таким образом, наблюдаемые вольтамперограммы смеси являются аддитивным сложением вольтамперограмм отдельных компонентов. При этом эффективность полимеризации метиленового синего оказывается заметно ниже, чем в отсутствие анилина, либо из-за неоптимальных условий полимеризации по рН, либо из-за высокой конкуренции со стороны анилина. В нейтральных и щелочных условиях анилин полимеризуется медленно, сигналы метиленового синего оказываются ниже наблюдаемых на стеклоуглероде, модифицированном УНТ, по-видимому, из-за частичного блокирования поверхности электрода непроводящим полианилином. Попытки совместной полимеризации анилина и метиленового зеленого не привели к улучшению характеристик покрытия. И в кислой, и в щелочной среде регистрируемые токи и обратимость электрохимических реакций получаемых покрытий были ниже, чем для чистого полианилина. Кроме того, метиленовый зеленый активно включался в растущий слой полианилина, что вело к его постепенному вымыванию в раствор при последующих процедурах модификации, включая иммобилизацию ДНК. Подобным образом вели себя тионин и толуидиновый синий. Благодаря наличию свободной аминогруппы в ароматическом кольце, они вступают в реакцию полимеризации аналогично анилину, что исключает блокирование поверхности УНТ непроводящими продуктами. Тем не менее, эффективность полимеризации, как и обратимость редокс-реакций продукта, смешанных покрытий толуидин (тионин) – полианилин уступала полианилину. Полученные смешанные продукты полимеризации на электроде, покрытом УНТ, оказались малостабильными. Поскольку редокс-пики хиноидных побочных продуктов окисления анилина и полимерных форм указанных соединений по потенциалам практически совпадали, на вольтамперограммах на стеклоуглероде и стеклоуглероде, покрытом УНТ, в области потенциалов 400 – 650 мВ фиксировали большой размытый пик, положение и ток пика которого в значительной степени варьировали при дальнейшей обработке электрода. Так, при последующем многократном циклировании потенциала электрода, последовательно модифицированного УНТ и полимерными смешанными покрытиями на основе полианилина и полимерных форм тионина, метиленового зеленого и толуидина наблюдалось вытеснение мономерных форм, в случае тионина и толуидина нельзя исключать и частичной деградации полимера, поскольку срок жизни сенсора при этом значительно сокращался по сравнению с кислотными средами. Термическая обработка электродов со смешанными покрытиями УНТ – полианилин – полифенотиазины приводила к значительному размыванию пиков и быстрому изменению их проницаемости для низкомолекулярных ионов. Процессы изменения состава покрытий после термической обработки продолжались, по крайней мере, 8 часов, что делало электроды малопригодными для последующей иммобилизации ДНК и олигонуклеотидов.


Разработанные электроды, модифицированные различными пленками, получаемыми путем сорбционного удерживания и полимеризации фенотиазинов, были испытаны в реакциях иммобилизации ДНК и олигонуклеотидов. Оказалось, что наибольшими перспективами для включения в состав ДНК-сенсоров обладают пленки на основе комплексов УНТ – поли(метиленовый синий) и УНТ – поли(метиленовый зеленый). Смешанные покрытия, включая синтезированные на основе полианилина, отличались недостаточной стабильностью состава и плохо удерживали ДНК в составе поверхностного слоя. Для иммобилизации использовали электростатическую адсорбцию на поляризованных электродах в режиме постоянной поляризации и в режиме разомкнутого контура (в отсутствие внешнего напряжения на электродах). Результаты показали, что каждый из предложенных способов имеет свои преимущества. Так, при поляризации электрода увеличивается емкость поверхностного слоя в отношении удерживаемого биополимера. Как и в случае полифенотиазинов, электрополимеризованных на гладком стеклоуглероде, наилучшие параметры стабильности покрытия, контролируемые по характеристикам электрохимического импеданса, были достигнуты, когда в процессе электростатической полимеризации потенциал электрода циклировали в интервале от -100 до 600 мВ. По-видимому, в этих условиях происходило выдавливание низкомолекулярных подвижных ионов, одноименных заряду пленки, и тем самым достигался более тесный контакт центров связывания спирали ДНК и полимерной матрицы. Адсорбция ДНК и олигонуклеотидов приводила к однотипным изменения сопротивления переноса заряда и емкости двойного слоя независимо от природы полимера и биокомпонента: происходило увеличение сопротивления за счет диффузионного торможения переноса и одновременно – некоторое снижение емкости в результате компенсации заряда УНТ и полиэлектролитного комплекса в целом. Указанные характеристики оказались достаточно чувствительными к условиям полимеризации и могут найти применение для контроля качества изготовления и работоспособности ДНК-сенсоров на основе разработанных преобразователей сигнала. В случае разомкнутого контура количества адсорбированного биополимера оказываются значительно ниже, однако устойчивость покрытия и время жизни ДНК-сенсора в целом оказываются больше, чем при иммобилизации в процессе циклирования потенциала. Необходимо также отметить, что сами УНТ в отсутствие фенотиазинов обладают достаточно высокой сорбционной емкостью по отношению к ДНК и белков сывороточного комплемента. В тех случаях, когда полимерные покрытия получали при малом числе циклов сканирования потенциала, т.е. когда часть поверхности УНТ не закрывалась полимером, селективность адсорбции оказалась ниже. Как следствие, сигнал ДНК-сенсора показал значительную чувствительность к присутствию балластных белков сыворотки крови, как было показано на примере альбумина при тестировании тромбина и сыворотки крови здорового донора при определении аутоиммунных антител к ДНК. Попытка совместить стадии получения полимера и иммобилизации ДНК путем включения ДНК в состав реакционной смеси для полимеризации в случае полиэлектролитных покрытий на основе полианилина оказалась неудачной: полученные покрытия в целом характеризовались теми же электрохимическими характеристиками, по-видимому, за счет капсулирования ДНК, адсорбированной на поверхности УНТ. Единственным исключением являлся метиленовый зеленый, для которого эффективность полимеризации в присутствии нативной ДНК в нейтральной и слабощелочной среде резко возрастала. Также увеличивался срок жизни сенсора. Тем не менее, последующие эксперименты по детектированию белков, связывающихся с ДНК, показали преимущества сенсоров, в которых слой биополимера наносили поверх слоя УНТ – полифенотиазин. Вероятно, это связано с частичной компенсацией заряда ДНК в комплексе с полимерами на поверхности электрода. В частности, при удалении ДНК в процессе кислотной обработки электрода слой поли(метиленового зеленого) демонстрировал более высокую емкость в отношении нативной ДНК и чувствительность детектирования антител к ДНК, чем аналогичный по способу получения полимер, синтезированный в отсутствие ДНК.


При использовании сорбционного накопления фенотиазиновых красителей в слое УНТ последующее нанесение ДНК в различных режимах иммобилизации показало в целом одинаковую картину: присутствие ДНК стабилизировало сигнал окисления-восстановления фенотиазина, который по зависимости тока пика от скорости развертки потенциала имел квазиобратимый и поверхностный сорбционный характер. Присутствие отрицательно заряженной ДНК стабилизировало окисленную форму фенотиазинового маркера, что приводило к некоторому смещению потенциала окисления в сторону менее анодных значений и увеличению соотношения токов анодного и катодного пика в сторону их уравнивания, что характерно для обратимой реакции. В целом, разработанные ДНК-сенсоры позволяли проводить определение сигнала фенотиазина в течение, по крайней мере, 25 циклов измерения в день. Это существенно лучше, чем параметры ДНК-сенсоров на основе полианилина, полученного на гладком стеклоуглеродном электроде в рамках выполнения данного проекта. 


Разработанные ДНК-сенсоры на основе стеклоуглеродных электродов, покрытых УНТ и различными полимерными комплексами с участием фенотиазинов и анилина, были испытаны в реакциях определения специфических антител к ДНК. Кроме того, были получены аптасенсоры, в которых в качестве биологического компонента использованы аптамеры состава 5’-GGT TGG TGT GGT TGG TTT TTT TTT TTT TTT TTT-3’, связывающие фибриноген-специфичный участок сериновой протеазы тромбина. И в случае ДНК-сенсора, и в случае аптасенсора на тромбин в качестве аналитического сигнала использовали электрохимические параметры поверхностного слоя, связанные с присутствующими в нем фенотиазиновыми (полианилиновыми) фрагментами. К ним относятся сопротивление и емкость переноса заряда (импедиметрические сенсоры), изменение стационарного потенциала при скачкообразном изменении рН (потенциометрические сенсоры) и измерение тока пика окисления фенотиазина (амперометрические сенсоры). Сравнение аналитических характеристик биосенсоров показало, что наибольшей чувствительностью к концентрации специфически связывающегося белка обладают импедиметрические сенсоры. Как отмечалось выше, для них характерно разнонаправленное изменение значений сопротивления переноса заряда и емкости поверхностного слоя при его последовательном усложнении (нанесении ДНК и контакте с анализируемой сывороткой крови и раствором тромбина). Это связано с различным распределением заряда в полиэлектролитном слое и общим возрастанием диффузионного сопротивления слоя. В отличие от других способов регистрации сигнала, параметры импедиметрических биосенсоров менее чувствительны к рН и изменению буферной емкости объекта контроля, а также позволяют осуществлять внутренний контроль целостности биочувствительного слоя в процессе последовательных стадий инкубирования по характерному соотношению регистрируемых параметров. По сравнению с аналогичными ДНК-сенсорами на гладких стеклоуглеродных электродах увеличивается чувствительность (наклон градуировочной зависимости) импедиметрического сигнала, при этом в ряде случаев при малых степенях заполнения поверхности и числе циклов сканирования потенциала, применяемом на стадии полимеризации, метод не дает адекватных результатов (нестандартная форма диаграмм Найквиста), поскольку требует подбора более сложной эквивалентной схемы, применяемой для расчета. Потенциометрические сенсоры отличаются наиболее простым протоколом измерения сигнала и способом его обработки. Как и в описанных ранее сенсорах на основе гладкого стеклоуглерода и полианилина, сигналом является смещение стационарного потенциала сенсора при скачкообразном изменении рН, измеренное относительно аналогичного скачка в отсутствие специфически связывающегося белка. Присутствие УНТ и фенотиазинов в поверхностном слое увеличивает чувствительность определения, что выражается в увеличении пика потенциала в области средних разбавлений сыворотки больных аутоиммунными заболеваниями (системная красная волчанка и аутоиммунный тиреоидит). По сравнению с полианилином, полифенотиазины, нанесенные поверх УНТ, дают сигнал, менее чувствительный к буферной емкости раствора. Предполагалось, что именно с влиянием буферной емкости было связано снижение отклика ДНК-сенсора на основе полианилина при разбавлениях 1:1 – 1:10. В случае покрытий УНТ-полифенотиазин изменение сигнала в области малых разбавлений существенно ниже, а изменение отклика при переходе к разбавлениям 1:50 – 1:100 – выше. Проведено сравнительное изучение влияния природы фенотиазина на чувствительность определения аутоиммунных антител к ДНК. Для сенсоров на основе комплексов ДНК – полианилин (полифенотиазины) на гладком стеклоуглероде наибольший сигнал на антитела к ДНК зафиксирован для полианилина, наибольшая чувствительность определения и наименьшее влияние сывороточных белков – для поли(метиленового зеленого). В присутствии УНТ наибольшая чувствительность определения зафиксирована для комплекса ДНК – поли(метиленовый синий). Для него же было установлено наименьшее влияние буферной емкости и рН сыворотки. Впервые предложен способ амперометрической регистрации сигнала по относительному изменению тока окисления фенотиазина в составе слоя УНТ – ДНК. Показано, что в результате взаимодействия ДНК или аптамера со специфически связывающимся белком происходит закономерное снижение тока окисления восстановленной формы маркера. Разработанный способ позволяет определять до 0.3 нМ тромбина и достоверно устанавливать присутствие ауто-антител к ДНК в сыворотке крови больных аутоиммунными заболеваниями при разбавлениях сыворотки до 1:200. Определена селективность отклика аптасенсора на основе различных полиэлектролитных комплексов с включением УНТ в отношении сывороточных белков. Сравнительная характеристика сигнала различных ДНК-сенсоров, отличающихся по структуре и способу получения поверхностного чувствительного слоя, показала, что присутствие фенотиазина в слое УНТ снижает предел обнаружения тромбина в 3-5 раз по сравнению с аналогичным сенсором на основе УНТ без медиатора электронного переноса. Также зафиксировано повышение чувствительности определения белков при включении фенотиазинов в состав дисперсии УНТ в ДМФА до нанесения на электрод по сравнению с послойным нанесением УНТ и фенотиазина из разных растворов. Предположительно, различия в характеристике сенсоров связаны с электростатическими взаимодействиями компонентов реакции ДНК-белок и, возможно, – с перезарядкой слоя УНТ в присутствии положительно заряженных медиаторов фенотиазинового ряда.

 

Степень новизны полученных результатов:
Новыми являются предложенные в исследовании пути стабилизации тонких пленок УНТ и полиэлектролитных комплексов УНТ-ДНК-фенотиазины на поверхности стеклоуглеродных электродов, способ измерения сигнала взаимодействия ДНК-белок по изменению импедиметрических характеристик переноса заряда в поверхностном слое, а также амперометрический способ регистрации сигнала ДНК-сенсора с адсорбированной мономерной формой фенотиазина в слое УНТ. Впервые проведено комплексное исследование влияния способа диспергирования УНТ и условий полимеризации на электрохимические характеристики полиэлектролитных комплексов ДНК, а также сравнение потенциометрических, амперометрических и импедиметрических ДНК-сенсоров, предназначенных для регистрации специфических взаимодействий ДНК - белок.

 

Сопоставление полученных результатов с мировым уровнем:
Применение УНТ в электроанализе приобретает все большее значение в силу несомненных достоинств, которыми обладает данный материал. Это высокая эффективность электронного переноса и адсорбционная емкость, широкая область рабочих потенциалов, совместимость с биологическими компонентами, применяемыми в составе биосенсоров [P. He, Y. Xu, Y. Fang, Microchim Acta 152 (2006) 175]. Хотя приготовление дисперсии УНТ, как и их включение в состав поверхностного слоя, требуют специальных предварительных стадий обработки, таких как окислительная активация или обработка ультразвуком, УНТ весьма стабильны в составе сенсоров и способны к образованию хорошо структурированных поверхностных слоев. Неспецифические взаимодействия с <пи>-электронными системами ароматических стенок УНТ и электростатическое притяжение к концевым карбоксильным группам способствуют эффективной аккумуляции низкомолекулярных соединений, которые затем могут окисляться на электроде или включаться в поверхностные реакции с участием других компонентов реакции.


Все эти свойства определяют перспективность применения УНТ в качестве модификаторов при разработке новых электрохимических сенсоров и биосенсоров. Описаны примеры функционирования биосенсоров с УНТ, применяемыми в качестве матрицы для иммобилизации биокомпонентов [Y.Zou, C.Xiang, L.Sun, F.Xu, Electrochimica Acta 53 (2008) 4089, J.Wang, M.Musameh, Anal. Lett. 36 (2003) 2041, K.Yamamoto, G.Shi, T.S.Zhou et al. Analyst 128 (2003) 249]. Применение УНТ в области биосенсорики было предметом рассмотрения нескольких обзоров [J.J.Gooding, Electrochimica Acta 50 (2005) 3049; J.Wang, Electroanalysis 17 (2005) 7; M.Trojanowicz, Trends in Anal.Chem. 25 (2006) 480; L.Ag, P.Y.Perez-Sedeno, J. M.Pingarron, Anal.Chim.Acta 622 (2008) 11]. Предложено включать дополнительные переносчики электрона для повышения селективности процесса, снижения рабочего потенциала измерения сигнала и увеличения регистрируемых токов, в частности, фенотиазинов. Азур, адсорбированный на хитозане, вносили в состав поверхностного слоя УНТ для повышения эффективности медиаторного окисления NADH. Толуидиновый синий [N.S. Lawrence, J.Wang, Electrochem. Commun. 8 (2006) 71], тионин [S.Shahrokhian, H.R.Zare-Mehrjardi, Electrochimica Acta 52 (2007) 6310; D.R.S.Jeykumari, S.Ramaprabhu, S.S.Narayanan, Carbon 45 (2007) 1340] и метиленовый синий [U.Yogeswaran, S.-M.Chen, Sensors Actuators B 130 (2008) 739] адсорбировали на УНТ и использовали для повышения чувствительности и селективности определения аскорбиновой кислоты, дофамина и пероксида водорода. Электроды, модифицированные УНТ, использовали для накопления инсулина [J. Wang, M. Musameh, Anal. Chim. Acta, 511 (2004) 33], альбумина [G.L.Luque, N.F.Ferreyra, G.A.Rivas, Talanta 71 (2007) 1282] и аминоксилот [B.Fang, Y.Wei, M.Li et al. Talanta 72 (2007) 1302; X.Chen, Y.Yang, M.Ding, Anal. Chim. Acta 557 ( 2006) 52] для их последующего окисления. Взаимодействие одноцепочечной ДНК с УНТ увеличивало сигнал окисления гуаниновых остатков, что было использовано для безреагентного определения гибридизации олигонуклеотидов [J. Wang, A.-N. Kawde, M. Musameh, Analyst, 2003, 128, 912]. УНТ обеспечивало также увеличение чувствительности регистрации индикаторной ферментативной реакции при регистрации гибридизации ДНК, модифицированной щелочной фосфатазой [J. Wang, A.-N. Kawde, M. R. Jan, Biosens. Bioelectron. 29 (2004) 995]. Присутствие УНТ способствовало образованию полиэлектролитных комплексов ДНК с электрополимеризованным полипирролом [G. Cheng, J. Zhao, Y. Tu et al. Anal.Chim.Acta 533 (2005) 11] или поли(метиленовым синим) [U. Yogeswaran, S.-M. Chen, Sensors Actuators B 130 (2008) 739]. Композиты УНТ-нафион использовали для электрополимеризации гидроксинафтилхинона, продукт которой служил матрицей для иммобилизации ДНК [D.F.Acevedo, S.Reisberg, B.Piro et al. Electrochimica Acta. 53 (2008) 4001]. Во всех указанных случаях сообщалось об образовании хорошо структурированных поверхностных слоев с расширенными возможностями электростатических и редокс-взаимодействий УНТ с ДНК. Тем не менее, известны только единичные публикации, посвященные сочетанию УНТ и полифенотиазинов [U.Yogeswaran, S.-M.Chen, Electrochimica Acta 52 (2007) 5985; U. Yogeswaran, S.-M. Chen, Sensors Actuators B 130 (2008) 739]. В этих публикациях функции УНТ и полимеров были разделены: УНТ применяли для структурирования поверхностного слоя и как матрицу для иммобилизации белков и ДНК, тогда как полимеры обеспечивали электронный перенос вне зависимости от особенностей пространственной структуры биологических компонентов. Возможности сочетания УНТ и полифенотиазинов практически остаются не реализованными, особенно в плане генерирования аналитического сигнала при определении специфически связывающихся белков.

 

Методы и подходы, использованные в ходе выполнения проекта:
Для нанесения УНТ и формирования полиэлектролитного комплекса ДНК - полифенотиазины (полианилин) использовали разработанный ранее коллективом авторов метод послойного электроосаждения компонентов чувствительного слоя с варьированием состава реакционной среды и условий для полимеризации. Измерение сигнала при определении тромбина и аутоиммунных антител к ДНК проводили, нанося на рабочую поверхность сенсора, закрепленного вертикально, 10-50 мкл анализируемого раствора. Для предотвращения высыхания электрод закрывали пластиковой пробиркой. После инкубирования ДНК-сенсор промывали рабочим буферным раствором и далее измеряли сигнал (потенциометрический - регистрируя динамическую кривую изменения потенциала во времени с последующим расчетом максимального изменения за 10-20 мин., импедиметрического - добавляя в раствор эквимолярную смесь феррицианидов калия и регистрируя зависимость активной и мнимой составляющей импеданса от частоты налагаемого напряжения, амперометрического - регистрируя ток пика на циклической вольтамперограмме). Все предлагаемые способы измерения сигнала являются авторскими, приоритет их создания закреплен соответствующими публикациями в реферируемых журналах. В качестве объектов контроля использовали модельные растворы тромбина, стандартные образцы сыворотки крови, а также образцы сыворотки крови здорового донора и больных аутоиммунными заболеваниями, предоставленные кафедрой аллергологии Казанской государственной медицинской академии. Все образцы крови больных тестировали на присутствие аутоиммунных антител с помощью стандартных методов иммуноферментного анализа.