ГРАНТ РФФИ 02-03-32888

"Гибридные электрохимические сенсоры с регулируемой селективностью на основе углеродных электродов, модифицированных полимерами с включенными замещенными каликсаренами"

ИТОГОВЫЙ НАУЧНЫЙ ОТЧЕТ (2004) г.

 

Синтезированы новые замещенные каликс[4]арены,перспективные комплексообразователи в составе ферментных сенсоров. С целью поиска эффективных модификаторов для включения в полимерные пленки получен ряд дизамещенных в нижнем ободе каликс[4]аренов в конформации конус. Селективным алкилированием по нижнему ободу 5,11,17,23-тетра-трет-бутил-25,26,27,28-тетрадигидроксикаликс[4]арена галогенпроизводными в ацетонитриле в присутствии карбоната калия получены новые дизамещенные каликсарены в конформации конус с выходом 60-80% с заместителями в нижнем ободе: пентафторфенильным, 4-пиридиллметоксильным, 4-карбоксиэтилбензильным, 9-флуоренилоксильным, 3-фенилпропен-2-илоксильным. Дальнейшей модификацией полученных соединений синтезированы каликс[4]арены, содержащие карбоксильные и амидные фрагменты. Впервые получен 5,11,17,23-тетра-трет-бутил-25,27-дигидрокси-26,28-бис[4-(карбокси)-бензилокси]каликс[4]арен. В реакции 5,11,17,23-тетра-п-трет-бутил-25,27-бис(аминоэтокси)-26,28-дигидроксикаликс[4]арена с ангидридом бензойной кислоты с выходом 70% получен 5,11,17,23-тетра-трет-бутил-25,27-бис(N-бензоил-амидоэтокси)-26,28-дигидроксикаликс[4]арен в конформации конус. По реакции переаминирования с выходами 60-70% синтезированы 5,11,17,23-тетра-трет-бутил-25,27-бис(N-октил-амидометокси)-26,28-дигидроксикаликс[4]арен и 5,11,17,23-тетра-трет-бутил-25,27-бис(N-бензил-амидокарбоксиметокси)-26,28-дигидрокси каликс[4]арен. Проведена функционализация верхнего обода каликс[4]арена ипсозамещением третбутильных групп на нитрогруппы. Структура полученных соединений подтверждена методами ЯМР 1Н-спектроскопии, масс-спектрометрии и данными элементного анализа. В ПМР спектрах полученных соединений сигналы мостиковых метиленовых протонов макроциклов проявляются в виде двух дублетов, что свидетельствует о нахождении полученных каликс[4]аренов в конформации конус. Следующим шагом стало изучение функционализации нижнего обода тиа-аналога п-трет-бутилтиакаликс[4]арена. Реакцией тетра-O-алкилирования п-трет-бутилтиакаликс[4]арена с альфа-бромацетоном и N,N-диэтилхлорацетамидом впервые получены и охарактеризованы различными физическими методами 5,11,17,23-тетра-трет-бутил-25,26,27,28-тетракис-(ацетилметокси)-2,8,14,20-тетратиакаликс[4]арен и 5,11,17,23-тетра-трет-бутил-25,26,27,28-тетракис-[(N,N-диэтиацетил)метокси]-2,8,14,20-тетратиакаликс[4]арен в конформациях конус, частичный конус и 1,3-альтернат. Стереоселективность реакции достигается темплатным эффектом катиона карбоната щелочного металла, используемого в качестве основания.Впервые разработана методика получения с высоким выходом 70-90% 1,3-дизамещенных по нижнему ободу п-трет-бутилтиакаликс[4]аренов в конформации конус - 5,11,17,23-тетра-трет-бутил-25,27-бис-[(бензоил)метокси]-26,28-дигидрокси-2,8,14,20-тетратиакаликс[4]арена, 5,11,17,23-тетра-трет-бутил-25,27-бис-(ацетилметокси)-26,28-дигидрокси-2,8,14,20-тетратиакаликс[4]арена, 5,11,17,24-тетра-трет-бутил-25,27-дигидрокси-26,28-бис(4-нитрофенилкарбамоил-метокси)тиакаликс[4]арена. Структура и конформация впервые полученных макроциклических соединений установлена методами одно- и двухмерной ЯМР,ИК-спектроскопии, масс-спектрометрии и рентгеноструктурного анализа. Для исследования взаимодействия синтетических рецепторов и ряда дикарбоновых, альфа-гидрокси- и альфа-аминокислот были применены спектрофотометрический метод и метод мембранной экстракции. Кинетические исследования массопереноса субстратов каликс[4]аренами через жидкие импрегнированные мембраны и спектрофотометрические исследования показали способность полученных синтетических рецепторов осуществлять молекулярное распознавание некоторых дикарбоновых, альфа-гидрокси- и альфа-аминокислот. Результаты исследований показали как эффективность, так и селективность некоторых исследуемых каликс[4]аренов. Установлено, что взаимодействие субстратов только с гидроксильными группами на нижнем ободе каликсарена недостаточно для связывания карбоновых кислот. Замена амидных фрагментов в нижнем ободе дизамещенного каликс[4]арена на эфирные приводит к изменению рецепторной способности – распознается не карбоксильная, а карбоксилатная группа. Тетразамещенный по нижнему ободу каликс[4]арен с кетонными фрагментами образует более устойчивые комплексы с изученными карбоновыми кислотами по сравнению с тетразамещенным каликс[4]ареном со сложноэфирными фрагментами. Установленные закономерности позволяют направленно менять рецепторную способность дистально замещенных каликс[4]аренов путем варьирования природы заместителей. Найден эффективный и селективный синтетический рецептор щавелевой кислоты – каликс[4]арен с метоксипиридильными фрагментами. Было изучено получение 25,26,27,28-тетразамещенных по нижнему ободу тиакаликс[4]аренов, заместители которых содержат амидные и пиридиновые фрагменты, в трех конформациях – конус, частичный конус и 1,3-альтернат. Первоначально макроциклическая платформа тиакаликс[4]арена была закреплена в требуемой конформации исчерпывающим алкилированием нижнего обода макроцикла избытком этилбромоацетата в присутствии карбоната щелочного металла в ацетоне посредством т.н. темплатного эффекта. Гидролиз водным раствором гидроксида лития синтезированных тетраэфиров (выход 58-80%) на основе тиакаликс[4]арена в течение 40 часов привел к образованию с выходом 90-100% соответствующих тетракислот (конус, частичный конус и 1,3-альтернат). Ацилированием тетрахлорангидридом на основе тиакаликс[4]арена, полученного in situ, соответствующего первичного амина (анилина, бензиламином, 2-аминопиридина) в хлористом метилене в присутствии триэтиламина с выходом 80-90 % впервые были синтезированы новые татраамиды на основе тиакаликс[4]арена в трех конформациях (конус, частичный конус, 1,3-альтернат). Структуры синтезированных соединений охарактеризованы рядом методов: ЯМР 1Н и 13С спектроскопией, MALDI-TOF масс-спектрометрией, ИК спектроскопией и двумерной ЯМР спектроскопией. Тетраамиды, содержащие NH-группу, на основе тиакаликс[4]арена в конформациях конус, частичный конус и 1,3-альтернат оказались неэффективными экстрагентами катионов щелочных металлов: степень экстракции менее 5%.Тиакаликс[4]арен в конформации 1,3-альтернат, содержащий о-амидопиридиновые фрагменты, демонстрирует высокую степень экстракции нитратов и пикратов серебра 98-100%.

 

Изучена активность новых синтезированных дистальных замещенных каликс[4]аренов и тиакаликс[4]аренов как ингибиторов фермента в реакции холинэстеразного гидролиза индофенилацетата. Как показали кинетические эксперименты, новые изученные соединения проявляют конкурентное ингибирующее и активирующее действие на нативную холинэстеразу, описываемое единой градуировочной зависимостью. Инверсия биохимического действия зависит от природы заместителя каликс[4]арена и проявляется в диапазоне концентраций 1-400 мкМ. Каликс[6]арен и тиакакаликс[6]арен, а также некоторые их замещенные проявляют неспецифическое необратимое действие на нативную холинэстеразу, по-видимому, вследствие сорбции на поверхности белковой глобулы за счет гидрофобных взаимодействий с аминокислотными остатками триптофана и,в меньшей степени, гистидина. Снижение ферментативной активности носит нерегулярный характер и слабо зависит от концентрации каликсарена в диапазоне 1 нМ - 1 мкМ, что не позволило использовать данный эффект для регистрации комплексообразования или количественного определения присутствия каликс[6]аренов в растворе. Чувствительность холинэстеразы к присутствию замещенных каликс[4]аренов определяется параметрами взаимодействия в системе фермент-субстрат (индофенилацетат) и субстрат-каликс[4]арен. Предположительно, изменение скорости холинэстеразной реакции связано с включением изученных каликс[4]аренов в комплексы с субстратом и соответствующими изменениями заряда поверхности и гидрофильно-гидрофобного баланса вблизи активного центра фермента. Снижение рН с 8 до 4-5 увеличивает чувствительность регистрации образования комплексов "гость-хозяин" за счет снижения сродства активного центра холинэстеразы к индофенилацетату. Так, полифторированное 1,3-дизамещенное по нижнему ободу производное показывает обратимое ингибирующее действие в слабокислой среде, а в нейтральной и щелочной среде на активность холинэстеразы не влияет. В пользу предлагаемого механизма взаимодействия говорит также изучение биохимической активности новых синтезированных макрополициклических структур, полученных путем [2+2]макроциклизации (бис- и трис-тиакаликс[4]арены), в которых потенциальный центр связывания стерически закрыт для подхода индофенилацетата. Указанные соединения полностью лишены ингибирующей способности и проявляют весьма слабое активирующее действие в микромолярном диапазоне концентраций. Также установлено, что ингибирующее действие ди- и тетразамещенных по нижнему ободу тиакаликс[4]аренов зависит от конформации и снижается в ряду 1,3-алтернат > 1,2-алтернат >> конус, что согласуется с изменением стерической доступности функциональных групп молекулы "хозяина" для взаимодействия с карбоксилатным фрагментом "гостя". Использование в качестве субстрата ферментативной реакции эфиров холина нивелирует влияние замещенных каликс[4]аренов, по-видимому, из-за электростатического и стерического влияния триметиламмонийного фрагмента молекулы субстрата. Слабое ингибирующее действие на нативный фермент демонстрируют только каликсарены с заместителями, содержащими алифатические аминогруппы, по-видимому, за счет их включения в комплекс с активным центром вместо субстрата. Использование ферментативной индикаторной реакции позволяет определять присутствие в растворе 2-500 мкМ исследованных соединений, что может найти применение при контроле технологических процессов мембранной очистки или переноса аминокислот через органические фазы.

 

Разработаны новые подходы к включению макрополициклических лигандов в состав ферментных сенсоров на основе графитовых электродов. С этой целью проведена оптимизация процессов электрополимеризации анилина, тирамина их смесей с ароматическими фенолами и аминами, фенотиазиновых красителей (метиленовый синий и зеленый) в присутствии замещенных каликс[4]аренов или комплексов "гость-хозяин" с органическими кислотами. В качестве допанта полимера использовали ди- и тетразамещенные трет-бутилкаликс[4]арены, содержащие ацетильные, метоксипиридиновые, ацетамидные, бензоильные фрагменты и аминогруппы. Определены параметры электролиза, позволившие получить устойчивые покрытия полианилина с повышенной адгезией к материалу электрода. Установлено оптимальное сочетание мономеров и добавок - сульфаниловой кислоты, фенола и каликсареновых кислот, содержащих карбоксилатные группы в заместителях,отвечающее наиболее устойчивому рН-отклику получающегося покрытия и наибольшему времени жизни химического сенсора на его основе. Разработанные модифицированные полианилиновые покрытия отличались более высокой устойчивостью в щелочной среде и расширенным диапазоном рН-чувствительности стационарного потенциала (рН 4.0-10.0, наклон электродной функции  70-80 мВ/рН) по сравнению с немодифицированным полианилином. Установлено влияние допирующих замещенных каликс[4]аренов на ионную функцию стационарного потенциала полианилинового сенсора проявляющуюся при поверхностной концентрации допанта 1-10 мкмоль /см2. Показано, что электрод, модифицированный полианилином, демонстрирует селективный отклик на галогенид-ионы в диапазоне концентраций 0.05-20 мМ в присутствии 100-1000-кратных избытков сульфатов, фосфатов и нитратов. Присутствие каликсареновых кислот повышает селективность определения ионов натрия и кальция среди катионов и иодидов среди анионов.Определены коэффициенты селективности и влияние на них каликсаренов - допантов в составе полимерного покрытия. С помощью ППП "Statgraphics" и собственных программ,реализующих метод искусственных нейронных сетей Кохонена (SOM), построены профили отклика химических сенсоров на основе полианилина с различными допирующими каликс[4]аренами в реальных многокомпонентных смесях неорганических и органических ионов, рассчитаны коэффициенты селективности бинарных и тринарных смесей.Для решения задач моделирования отклика проведено дооснащение компьютера. Исследованы характеристики устойчивости полимерных покрытий, полученных при электролизе фенилендиаминов, аминофенолов, метиленового зеленого и синего, Meldola Blue в присутствии гидрохинона и тирамина. Как показано, образующиеся полимерные пленки обладают высокой сорбционной и электрохимической активностью, но менее устойчивы по сравнению с полианилином. Полифенотиазины не меняли своих характеристик в присутствии каликс[4]аренов, заместители которых содержали карбоксилатные группы, амино-, амидо- и пиридиновые фрагменты, по-видимому, из-за слабого удерживания допантов в носителе. Полимеры на  основе ароматических спиртов проявляли низкую электропроводность и отсутствие потенциометрического  отклика на большинство неорганических ионов. Разработанные смесевые покрытия на основе политирамина  были с успехом применены для стабилизации пероксидазы и холинэстеразы, однако присутствие в них каликсаренов на характеристики ферментов не влияло.

 

Преобразователи сигнала на основе графитовых электродов, модифицированные полианилином, содержащим каликс[4]арены с карбоксилатными и метоксипиридиниевыми заместителями, были использованы в составе потенциометрических и амперометрических сенсоров с холинэстеразой и пероксидазой, иммобилизованных поверх  полианилина кросс-сшивкой глутаровым альдегидом. Как показано, чувствительность определения субстратов  холинэстераз, эфиров тиохолина, в присутствии  дизамещенных каликс[4]аренов на 20-40% выше рН- чувствительности сигнала преобразователя. Снижены пределы обнаружения ацетилтиохолина до 0.1 мкМ.Каликс[4]арены в составе модифицирующего слоя снижают мешающее влияние компонентов матрицы при определении ингибиторов холинэстеразы. В частности, подавляется мешающее влияние ионов переходных металлов, фторидов и иодидов, что проявляется в подавлении их ингибирующего действия и уменьшении дрейфа потенциала электрода при его контакте с минерализованными средами. В амперометрическом режиме при проведении измерения с эфирами тиохолина в качестве субстрата холинэстеразы,напротив, повышается чувствительность сигнала к присутствию ионов меди(II), серебра, свинца. Их присутствие в растворе приводит к закономерному  увеличению тока окисления тиохолина и снижению рабочего потенциала, что связано с образованием тройных комплексов каликсарен - ион металла - тиол на  поверхности сенсора. Аналогичные процессы накопления  металлов в режиме прямой и инверсионной вольтамперометрии (химические сенсоры) были изучены с теми же каликс[4]аренами, включенными в состав угольной пасты (до 15 масс.%). Как показано, химические сенсоры в сходных условиях измерения сигнала дают меньшую чувствительность определения ионов металлов, но более высокую селективность за счет разделения процессов анодного растворения металлов после их сорбционного катодного накопления на поверхности и в поверхностном слое электрода. Хотя разработанные химические сенсоры по определяемым концентрациям металлов сильно уступают классической инверсионной вольтамперометрии, они могут найти применение в технологическом и эколого-аналитическом контроле суммарного содержания тяжелых металлов в сточных водах. Полианилиновые и полифенотиазиновые (на основе метиленового синего и метиленового зеленого) покрытия были использованы в составе пероксидазного сенсора для высокочувствительного определения субстратов пероксидаз. Определены условия сорбционного накопления промазина и хлоропромазина на полианилине, допированном тетраметилсульфонатным производным каликс[4]резорцинарена и его аналогами, содержащими алифатические спейсеры в боковых цепях. Показано, что сорбционное накопление промазина и хлоропромазина за счет взаимодействия с амфифильными производными каликс[4]резорцинарена приводит к значительному повышению сигнала их пероксидазного окисления и снижению предела обнаружения до 0.1-0.07 мкМ. Удлинение боковых радикалов с метильного до гептильного подавляет процессы сорбционного накопления, возможно, вследствие неблагоприятной ориентации допантов в слое полианилина. Изучены аналитические характеристики определения субстратов пероксидаз (гидрохинон, анилин, замещенные анилины и фенолы) с помощью пероксидазного сенсора на основе электродов, покрытых полифенотиазиновыми покрытиями и допированные каликсареновыми кислотами. Показано, что присутствие каликс[4]аренов снижает эффективность пероксидазного окисления субстратов и селективность измерения сигнала восстановления образующихся продуктов, возможно, из-за дополнительного диффузионного торможения переноса субстратов к активному центру фермента или разобщению цепи переноса электрона через проводящий слой полимера. Установлена возможность прямого электронного переноса с электрода на активный центр пероксидазы с участием полифенотиазинового или полианилинового слоев. Включение в перенос электрона замещенных каликсаренов с антрахиноновыми, нитрофенильными и нитробензильными заместителями, а также промазина и хлоропромазина в составе комплекса "гость-хозяин" меняет эффективность переноса электрона и ток биокаталитического восстановления пероксида водорода. Изменение сигнала прямого переноса электрона в присутствии комплексов "гость-хозяин" использовано для количественного определения промазина, хлоропромазина в микромолярном диапазоне их концентраций в присутствии тетраметилсульфонатных производных каликс[4]резорцинарена. Показано что эффективность  переноса электрона с участием изученных электрополимеризованных покрытий увеличивается в ряду поли(метиленовый зеленый) < допированный поли(метиленовый синий) < поли(метиленовый синий) < допированный полианилин < полианилин. Влияние допантов, не содержащих легко окисляющиеся фрагменты, выражается в уменьшении скорости переноса электрона независимо от природы заместителей каликс[4]аренов и тиакаликсаренов.

 

Получены смесевые покрытия на основе полианилина с ковалентно связанными замещенными каликс[4]аренами, содержащими легко окисляющиеся фрагменты. Для получения покрытия были изучены условия восстановления каликс[4]аренов, содержащих нитрогруппу в заместителях верхнего или нижнего обода. В кислой среде указанные соединения необратимо восстанавливаются с образованием нерастворимых соединений, осаждающихся на графите. Последующая полимеризация анилина приводит к образованию покрытий с улучшенной адгезией к электроду и повышенной стабильностью при хранении в сухом виде. Определены рабочие условия электролиза и последующей иммобилизации пероксидазы для получения пероксидазного сенсора, Как показано, эффективность переноса электрона на таком электроде в 3.2-4.5 раза выше по сравнению с аналогичным пероксидазным сенсором на основе немодифицированного электрода и в 2-2.5 раза выше по сравнению с пероксидазным сенсором, включающим полианилин. Неорганические и органические ионы, способные к комплексообразованию с каликс[4]аренами, меняют эффективность переноса электрона и сигнал сенсора.  Изменение чувствительности к низкомолекулярным соединениям - "гостям" меняется симбатно характеристикам комплексообразования, определенным независимыми методами. Разработаны методики определения щавелевой и  глутаминовой кислот, глицина и ионов серебра, кадмия и меди (II) в диапазоне концентраций 1 мкМ - 10 мМ. Установлены условия регенерации сигнала пероксидазного сенсора и контроля качества смешанного покрытия между измерениями сигнала.