ГРАНТ РФФИ 03-03-32492

"Электрохимические ДНК-сенсоры с ферментативным усилением сигнала"

ИТОГОВЫЙ ОТЧЕТ ЗА 2005 г.

 

Объявленные ранее цели проекта:
Проект направлен на решение фундаментальной научной проблемы - создание новых электрохимических биосенсоров для высокочувствительного обнаружения аффинных взаимодействий низкомолекулярных соединений и нуклеиновых кислот, в том числе для создания средств современной диагностики лекарственных препаратов и скрининга ДНК-повреждающих факторов. В рамках данной фундаментальной проблемы предполагалось создать и изучить новый тип электрохимических ДНК-сенсоров, в конструкции которых ферменты включены наряду с нуклеиновыми кислотами, иммобилизованными на поверхности различных преобразователей сигнала. Повышения чувствительности обнаружения слабых взаимодействий с участием ДНК и различных низкомолекулярных компонентов (лекарственные препараты сульфаниламидного и фенотиазинового рядов, интеркаляторы и др.) предполагалось достичь за счет вовлечения реагирующих веществ в конкурентную ферментативную реакцию в качестве субстрата или ингибитора. Для решения поставленной задачи предполагалось решить следующие задачи:
1. Изучить условия иммобилизации биохимических компонентов и определить оптимальные параметры регистрации аналитического сигнала. Определить рабочие условия иммобилизации ДНК и пероксидазы в белковых пленках, матрицах на основе политирамина в среде, исключающей их инактивацию, а также характеристики образующихся поверхностных пленок, включая однородность состава, проницаемость, стабильность, время жизни и условия регенерации.
2. Установить возможность регистрации аффинных взаимодействий низкомолекулярных компонентов и нуклеиновых кислот с помощью разработанных ДНК-сенсоров с биохимическим усилением сигнала. Предложить два варианта регистрации аффинных взаимодействий - путем вовлечения маркеров - фенотиазинов - в конкурентную реакцию с индикаторным ферментом пероксидазой и по изменению прочности связывания специфических антител к ДНК. 
3. Разработать способы высокочувствительного определения низкомолекулярных соединений, способных к взаимодействию с ДНК, - сульфаниламидов и антрациклиновых антибиотиков, а также загрязнителей окружающей среды. Провести оценку селективности сигнала биосенсоров в отношении указанных соединений, найти условия регенерации ДНК-сенсоров и их многократного использования.
В том числе, в 2005 г. планировались исследования в следующих направлениях:
1. Высокочувствительное определение с помощью ДНК-пероксидазного сенсора промазина и хлоропромазина с использованием метиленового синего и метиленового зеленого в качестве маркеров взаимодействия определяемых соединений с компонентами биочувствительного слоя биосенсора. Установление рабочих условий определения промазина и хлоропромазина в зависимости от природы маркера, его концентрации, оценка количественных характеристик накопления определяемых соединений в реакции с ДНК в зависимости от способа получения поверхностного покрытия и генерирования аналитического сигнала биосенсора.
2. Сравнительное исследование поведения маркеров (субстратов пероксидазы) и низкомолекулярных определяемых соединений (ионы переходных металлов, ароматические амины, антиоксиданты, сульфаниламиды) в присутствии нативной и денатурированной ДНК. Установление факторов, определяющих чувствительность определения различных групп соединений в соответствии с характером их взаимодействия с ДНК. 
3. Изучение возможности получения аналитического сигнала ДНК-
пероксидазного сенсора в присутствии полиэлектролитов и гетерогенных медиаторов электронного переноса с целью повышения чувствительности и селективности определения низкомолекулярных веществ - лекарственных препаратов и генотоксикантов, в том числе с использованием в качестве электропроводящего компонента других полимерных материалов и комплексов на основе производных полиэтиленгликоля, нафиона, привитых полистиролов, а в качестве модификатора электрода - полианилина и берлинской лазури.

 

Степень выполнения поставленных в проекте задач:
Поставленные на 2005 г. и на весь срок выполнения проекта задачи выполнены. Поскольку нильский голубой и мелдола голубая не показали высокой эффективности определения аффинных взаимодействий в составе ДНК-пероксидазного сенсора, основные исследования были сконцентрированы на изучении сигнала двух других фенотиазиновых маркеров - метиленового синего и метиленового зеленого. По сравнению с первоначальными задачами расширен перечень соединений, определяемых с помощью ДНК-пероксидазного сенсора (промазин, хлоропромазин, цефтазидим, этидиум бромид). Дополнительно изучены возможности применения в составе ДНК-пероксидазных сенсоров новых матриц для иммобилизации биологических компонентов, обеспечивающих гетерогенный электронный перенос между пероксидазой и электродом - поли(метиленового синего), поли(метиленового зеленого) и полианилина.

 

Полученные за отчетный период важнейшие результаты:
Изучены условия иммобилизации ДНК и пероксидазы на поверхности золотых и стеклоуглеродных электродов с целью получения устойчивого воспроизводимого сигнала в отношении органических соединений - субстратов фермента, способных к специфическому связыванию с ДНК. Для этого были разработаны простые в исполнении и эффективные способы иммобилизации индикаторного фермента и ДНК в белковых матрицах и в пленках электрополимеризуемых покрытий на основе полианилина и сополимера анилина и тирамина. Также были изучены возможности получения комплексов ДНК-пероксидаза с последующим включением в состав поверхностного слоя биосенсора.
Иммобилизация в белковых пленках. Перед иммобилизацией электроды активировали путем многократного циклирования его потенциала и последующего кондиционирования при +1.2 В (стеклоуглерод) или +0.8 В (золото) отн. Ag/AgCl. Такая обработка стабилизировала адсорбированную ДНК на электроде и препятствовала ее смыву при последующей иммобилизации белковых компонентов и измерении сигнала. Присутствие ДНК на поверхности электрода стабилизировало активность иммобилизованной пероксидазы, увеличивая время жизни биосенсора с 1-2 недель для пероксидазы, иммобилизованной в пленке альбумина, до 3-4 месяцев в присутствии 0.1-1.0 мкг см-2 ДНК при одинаковых условиях иммобилизации фермента. Введение в поверхностный слой ДНК не меняло кинетических параметров иммобилизованной пероксидазы по сравнению с нативным ферментом, но незначительно смещало рН-максимум от рН 6.5 до 7.0 (фосфатный буферный раствор). Сигнал ДНК-пероксидазного сенсора в отношении пероксида водорода и гидрохинона в качестве второго субстрата закономерно возрастал с увеличением поверхностной концентрации ДНК до величины 0.4 мкг см-2. Дальнейшее увеличение количества ДНК приводило к резкому снижению токов в силу диффузионного торможения переноса субстратов через непроводящий слой биополимера. Наилучшие результаты определения субстратов пероксидазы были получены при совместном внесении пероксидазы и ДНК. При послойном нанесении тех же компонентов с промежуточным высушиванием каждого слоя величина и воспроизводимость сигнала были ниже. Присутствие до 1 мг см-2 белков стабилизирует активность иммобилизованной пероксидазы независимо от присутствия ДНК на электроде.


Комплекс пероксидаза - ДНК.  Иммобилизация с применением электрополимеризуемых матриц. Изучены возможности иммобилизации ДНК и пероксидазы в полимерных пленках, получаемых путем электрополимеризации тирамина или анилина. Главной особенностью покрытий на основе политирамина является возможность проведения иммобилизации биологических компонентов путем кросс-сшивки с участием алифатических аминогрупп заместителей, не участвующих в процессе полимеризации. Достоинством разработанной методики является возможность проведения полимеризации в нейтральной или слабощелочной среде, что исключает инактивацию биополимеров, происходящую в присутствии сильных минеральных кислот, требующихся обычно для проведения полимеризации производных анилина [F.Palmisano, P.G.Zambonin, D.Centonze, Fresenius J.Anal.Chem. 366 (2000) 586-601]. Тирамин растворяли в смеси метанола и фосфатного буферного раствора и далее полимеризовали путем циклирования потенциала между -0.15 и +0.80 В. Рост полимерной пленки сопровождался снижением величины тока окисления в силу низкой электропроводности политирамина. Исходя из оптимального сочетания емкости покрытия в отношении белков и ДНК и величины остаточной силы тока оптимальным является получение покрытия в 3-7 циклах. При совместной полимеризации тирамина ряда замещенных анилинов и фенолов (м- и п-фенилендиамин, изомеры аминофенола и толуидина) образуются более проницаемые покрытия, отличающиеся высокой адгезией к материалу электрода и большими значениями регистрируемого сигнала низкомолекулярных соединений - субстратов пероксидазы. Нами не зафиксировано прямого электронного переноса на активный центр пероксидазы с участием ароматических систем покрытий на основе тирамина. Наилучшие результаты были получены при проведении электрополимеризации эквимолярной смеси тирамина и о-аминофенола. Пероксидазные сенсоры с ферментом, иммобилизованным в матрице сополимера тирамина и о-аминофенола отличаются повышенной стабильностью сигнала при хранении и использовании (до 5 месяцев при
комнатной температуре) и высокой удельной активностью иммобилизованного фермента по сравнению с иммобилизацией пероксидазы в белковых пленках. Кроме того, на электродах, модифицированных политирамином и аналогичными смесевыми покрытиями, электрохимические реакции фенотиазиновых соединений - субстратов пероксидазы - не осложнены реакциями олигомеризации и не сопровождаются образованием их сорбционных пиков на вольтамперограммах. Тем не менее, при использовании матрицы на основе сополимеров тирамина не удалось зафиксировать воспроизводимого влияния ДНК в составе биочувствительного слоя на скорость пероксидазного окисления фенотиазинов, возможно, в силу более плотного заполнения поверхности преобразователя сигнала и меньшей эффективности реакции катодной регенерации активной формы медиатора. Поскольку ДНК, как и политирамин, обладает незначительной электропроводностью, даже слабые изменения в параметрах пленки будут значительно менять характеристики пассивного диффузионного переноса и электрического сопротивления покрытия, что приводит к высокой погрешности измерения сигнала.


Нами также были синтезированы электропроводящие покрытия на основе анилина, метиленового синего и метиленового зеленого, полимеризацию которых проводили в условиях циклирования потенциала соответственно в 0.2 М серной кислоте и рабочем фосфатном буферном растворе (рН 7.5-8.0). Оптимальный режим электрополимеризации включал 10 циклов сканирования при скорости развертки потенциала 50-100 мВ/с. В отличие от политирамина и смешанных покрытий на его основе, образующиеся покрытия обладали высокой электропроводностью и редокс-активностью, о чем можно судить по росту анодно-катодных пиков, относимых к окислительно-восстановительным превращениям образующихся олигомеров. Кроме того, полимеризацию анилина проводили в присутствии добавок, стабилизирующих растущую пленку полимера. Исходя из литературных сведений, в качестве таких добавок были выбраны полианионные вещества - полистиролсульфонат, нафион, а также медиаторы электронного переноса. Как показало вольтамперометрическое изучение, в присутствии полианилина и его комплексов с полианионными компонентами наблюдается заметное ускорение прямого электронного переноса на активный центр фермента. Об этом свидетельствует генерирование катодного тока биокаталитического восстановления пероксида водорода, наблюдаемого при -50 мВ отн. Ag/AgCl в отсутствие низкомолекулярных медиаторов электронного переноса - вторых субстратов пероксидазы. Добавление в раствор метиленового синего и метиленового зеленого приводит к частичному или полному подавлению прямого электронного переноса, вместо него появляется пик катодного тока восстановления окисленной формы медиатора при -150.. -250 мВ. Конкуренция прямого и медиаторного электронного переноса зависит от присутствия в составе поверхностного слоя ДНК и природы медиатора. Метиленовый синий полностью подавляет прямой электронный перенос, тогда как метиленовый зеленый в малых концентрациях как второй субстрат пероксидазы неэффективен, поэтому пик при -50 мВ сохраняется. Сорбционное накопление
метиленового зеленого затрудняет разделение пиков и интерпретацию механизма формирования сигнала, однако по значениям константы Михаэлиса и скорости гетерогенного электронного переноса можно судить и о том, что оба процесса восстановления окисленного активного центра пероксидазы реализуются одновременно во всем диапазоне изученных концентраций медиатора. Введение в состав поверхностного слоя ДНК поверх слоя полианилина с последующей иммобилизацией фермента кросс-сшивкой глутаровым альдегидом приводит к стабилизации и увеличению сигнала фенотиазиновых субстратов пероксидазы, но при этом полностью подавляется прямой электронный перенос на активный центр фермента. Вероятно, это происходит в результате увеличения поверхностной концентрации фенотиазинов. Определены рабочие условия получения наиболее устойчивых покрытий полианилина, в том числе в присутствии берлинской лазури и ряда других окислителей, способствующих инициированию роста цепи. Присутствие гетерогенных медиаторов отрицательно сказывается на возможности регистрации активности пероксидазы, поскольку рабочие сигналы используемых для этого медиаторов (вторых субстратов) перекрываются с анодно-катодным пиком берлинской лазури, что затрудняет количественную характеристику отклика. Полимеризацию метиленового синего и метиленового зеленого проводили на стеклоуглеродном электроде до или после физической адсорбции ДНК. В отличие от полианилина, процесс эффективно шел в щелочной среде, но попытки полимеризации в присутствии пероксидазы не привели к улучшению характеристик пероксидазного определения субстратов. Полученные покрытия полифенотиазинов показывали на вольтамперограммах обратимый анодно-катодный пик, высота которого увеличивалась в процессе циклирования потенциала. Лимитирующей стадией процесса полимеризации является образование первичного радикального продукта окисления, инициирующего рост цепи, поэтому результаты циклирования определяются значением максимального потенциала (точки поворота). Эффективная
полимеризация начинается только в том случае, если эта величина превышает +1.0 В, тогда как для полимеризации анилина достаточно +0.8 В. Полифенотиазины являются эффективными медиаторами электронного переноса, обеспечивая увеличение сигнала гидрохинона и ряда других органических субстратов пероксидазы в диапазоне их концентраций 1.0 мкМ - 10 мМ. В то же время, они нивелируют вклад ДНК в биохимические реакции, возможно, в силу более эффективного взаимодействия с фосфатными остаткам спирали ДНК по сравнению с полианилином. Попытки использования для конструирования ДНК-пероксидазного сенсора аналогичных продуктов электрополимеризации других феноксазиновых медиаторов, нильского голубого и мелдолы голубой, оказались неудачным, поскольку продукты полимеризации показали необратимое окисление на стеклоуглеродном электроде в нейтральных и слабощелочных средах, соответствующие пики имели размытый, плохо воспроизводимый характер со значительным емкостным током заряжения и сорбционной составляющей сигнала. Сравнительное изучение различных способов иммобилизации ДНК и пероксидазы на белковых и электрополимеризованных покрытиях позволило заключить, что при определении аффинных взаимодействий с ДНК предпочтительнее использовать белковые пленки, тогда как определение субстратов пероксидазы и пероксида водорода более чувствительно в присутствии электропроводящих полимеризованных покрытий на основе полианилина и полифенотиазинов. В последнем случае влияние ДНК на сигнал биосенсора проявляется значительно слабее, нежели при использовании для иммобилизации в качестве матрицы альбумина или желатина.


Получены коньюгаты нативной ДНК с пероксидазой с последующим их включением в состав поверхностного слоя сенсора. Предполагалось, что в результате более тесного контакта и регулярной структуры комплекса его применение позволит повысить устойчивость биочувствительного слоя при хранении и использовании и чувствительность активности пероксидазы к веществам, взаимодействующим с ДНК. Коньюгат осаждали из раствора ДНК и фермента в присутствии высоких концентраций неорганических солей с последующей очисткой методом аффинной хроматографии. Выделение коньюгата возможно только в фосфатном буферном растворе и сопровождается снижением активности пероксидазы вследствие стерического ограничения доступа субстратов. После физической сорбции на электроде коньюгат дополнительно обрабатывали глутаровым альдегидом, поскольку электростатические взаимодействия заряженных маркеров дестабилизировали коньюгат и приводили к ускоренному вымыванию фермента. По сравнению с аналогичным сенсором, в котором нанесение компонентов поверхностного слоя проводили послойно, ДНК-пероксидазный сенсор на основе комплексов ДНК-фермент показал более высокую чувствительность сигнала к антителам к ДНК. При использовании стандартной антисыворотки максимально определяемое разбавление составило 1:500 по сравнению с 1:200 для биосенсора с нерегулярным строением поверхностного слоя.


Проведено сравнительное изучение аналитических характеристик определения ряда органических субстратов пероксидазы - гидрохинона, метиленового синего и метиленового зеленого на электродах, покрытых ДНК, денатурированной ДНК, на пероксидазном сенсоре и на электроде, содержащем в поверхностном слое одновременно пероксидазу и нативную или денатурированную ДНК. Все эксперименты проводили на фоне 1.0 мМ пероксида водорода, отвечающего наиболее устойчивому и воспроизводимому сигналу. Для регенерации сигнала фенотиазиновых красителей, обладающих высокой сорбционной активностью и склонностью к образованию непроводящих полимерных продуктов окисления, была разработана процедура регенерации ДНК-пероксидазного сенсора, позволяющая эффективно удалять избыток маркеров после измерения сигнала. Очистка включает кондиционирование электрода при анодном поляризующем напряжении +0.65 - +0.80 В отн. Ag/AgCl в течение 10 мин. Мешающее влиянии адсорбции в большей степени проявляется для метиленового зеленого, чем для метиленового синего, и для золотого электрода по сравнению со стеклоуглеродным электродом. Как было показано, увеличение сигнала органических субстратов пероксидазы (далее - маркеры) связано с их специфическим накоплением в реакции с ДНК в результате электростатических взаимодействий с фосфатным остовом ДНК, включением фенотиазиновых маркеров в состав спирали ДНК (их интеркалированием) или взаимодействием со свободными нуклеиновыми основаниями негибридизированных участков ДНК. Наибольшее влияние ДНК установлено для метиленового синего, способного взаимодействовать с нативной и денатурированной ДНК по гуаниновым нуклеиновым основаниям, а также накапливаться на поверхности спирали в области малых бороздок в участках спирали, богатых парами аденин-тимин [R.Rohs, H.Sklenar, J. Biomolecular Structure Dynamics 21 (2004) 699-711]. Введение ДНК в состав пероксидазного сенсора приводило к снижению предела обнаружения метиленового синего с 5 мкМ до 0.3 мкМ. То, что, по крайней
мере, часть маркера способна к координации вне дуплекса ДНК по малым бороздкам, было подтверждено результатами сканирующей микрокалориметрии, установившей отличия в термограммах ДНК, полученных в присутствии эталонного интеркалятора - этидиума бромида,- и метиленового синего. Таким образом, метиленовый синий на поверхности сенсора присутствует в нескольких формах, различающихся по доступности - интеркалированной (пассивной), координированной по поверхности спирали ДНК (активной в реакциях пероксидазного и электрохимического окисления) и не специфически сорбированной. Сигнал метиленового синего закономерно увеличивался в ряду стеклоуглеродный электрод < электрод, модифицированный ДНК, < пероксидазный сенсор < ДНК-пероксидазный сенсор, причем общее увеличение сигнала составило до 10 раз по сравнению с прямым окислением маркера. При внесении в раствор метиленового синего сигнал ДНК-пероксидазного сенсора стабилизировался к 10-15 мин. После 40 мин. инкубирования он вновь возрастал с выходом на предел к 40 мин., при этом сорбционное накопление маркера становилось необратимым и полное его удаление с поверхности сенсора требовало механической зачистки поверхностного слоя и повторной иммобилизации биологических компонентов.


В случае метиленового зеленого увеличение сигнала при внесении ДНК в поверхностный слой фермента на поверхности сенсора составило максимум 30-40% и монотонно увеличивалось со временем в течение 40 мин. инкубирования в результате электростатического накопления заряженных молекул субстрата в поверхностном слое. Эффективность пероксидазного окисления метиленового зеленого как нативной, так и иммобилизованной пероксидазой оказалась невысокой. Регистрируемые токи восстановления окисленной формы маркера не превосходили по величине токи его прямого окисления в режиме циклической вольтамперометрии на чистом стеклоуглеродном электроде. Напротив, внесение ДНК даже в отсутствие пероксидазы существенно увеличивало сигнал в результате увеличения поверхностной концентрации деполяризатора. Разработанный ДНК-пероксидазный сенсор был использован для измерения концентрации соединений, способных к аффинным взаимодействиям с двунитевыми молекулами ДНК.


Сульфаниламиды (сульфаметоксазол, сульфатиазол, сульфагуанидин, сульфамеразин и сульфадиазин). Как было показано методом сканирующей микрокалориметрии для сульфаметоксазола, данные соединения связываются с нативной ДНК аналогично метиленовому синему, в результате чего могут конкурировать с ним за центры связывания при нахождении в одном растворе. Влияния препаратов в изученном диапазоне их концентраций на активность нативной пероксидазы и сигнал пероксидазного сенсора в отсутствие ДНК обнаружено не было. При концентрации метиленового синего 0.4 мкМ и продолжительности контакта 10 мин. наблюдается обратимое снижение сигнала ДНК-пероксидазного сенсора в наномолярном интервале концентраций сульфаниламидов. С наибольшей чувствительностью определяется сульфаметоксазол (предел обнаружения 0.004 нМ, диапазон определяемых концентраций 0.01-0.1 нМ). При увеличении концентрации сульфаниламидов до 0.1-10 мкМ изменение сигнала метиленового синего носит менее регулярный характер. Ингибирующее действие антибиотиков снижается, для сульфаметоксазола и сульфатиазола проявляется незначительное (до 10-25%) возрастание сигнала маркера. Аналогичное влияние оказывает увеличение продолжительности инкубирования с 10 до 40-60 мин. Вероятно, увеличение токов связано со смещением равновесия интеркалирования метиленового синего в сторону его высвобождения из спирали ДНК, в результате чего его доступность для электрохимического и ферментативного превращения возрастает. Увеличение концентрации метиленового синего с 0.4 мкМ до 4.0 мкМ закономерно снижает чувствительность определения сульфаниламидов, при дальнейшем увеличении концентрации маркера чувствительность его сигнала к присутствию указанных препаратов исчезает. При использовании в качестве маркера метиленового зеленого действие 0.11-10 мкМ сульфаниламидов становится разнонаправленным. Сульфаметоксазол, сульфатиазол и сульфагуанидин вызывают незначительное увеличение сигнала ДНК-пероксидазного сенсора, сульфадиазин - его уменьшение. Включение в состав биосенсора термически денатурированной ДНК увеличивает абсолютное значение и наклон градуировочных зависимостей сульфаниламидных препаратов по сравнению с нативной ДНК при одной и той же концентрации маркера. Однако в силу меньшей воспроизводимости характеристик биосенсора с денатурированной ДНК минимальная концентрация маркера составила 4.0 мкМ, поэтому определяемые в присутствии денатурированной ДНК концентрации сульфаниламидов оказались в целом несколько выше, чем в случае нативной ДНК с концентрацией метиленового синего 0.4 мкМ. В присутствии денатурированной ДНК также существенно уменьшалось различие в поведении биосенсора при использовании в качестве маркеров метиленового синего и метиленового зеленого. Попытки использования иных способов денатурации ДНК, в том числе с использованием комплексов меди (II) и гидроксидных радикалов, генерируемых в реакции Фентона, не привели к улучшению характеристик определения сульфаниламидов, поскольку после денатурации на вольтамперограммах появлялись анодно-катодные пики ионов меди, оставшихся в составе поверхностного слоя. Кроме того, радикальное окисление нативной ДНК приводило к резкому увеличению токов маркеров, на фоне которых снижение сигнала в присутствии сульфаниламидов оказалось незначительным. Применение термически денатурированной ДНК в составе сенсора можно рекомендовать для определения суммарного количества сульфаниламидов, тогда как нативная ДНК дает возможность определить наномолярные концентрации сульфаметоксазола на фоне 100-1000-кратных избытков других препаратов. Измерения с использованием метиленового зеленого позволяют выделить вклад в сигнал возможное влияние на сигнал биосенсора субстратов пероксидазы, не взаимодействующих с ДНК.


Результаты определения сульфаниламидных препаратов были сравнены с чувствительностью и селективностью ДНК-ферментных сенсоров на основе холинэстеразы или пероксидазы, разработанных ранее для определения антител к ДНК. В них мерой содержания сульфаниламидов в анализируемом растворе служило изменение прочности связывания специфических антител, выделенных из сыворотки крови больных системной красной волчанкой. Взаимодействие ДНК - антитела к ДНК регистрировали по скорости ферментативной реакции, лимитированной доступностью фермента в составе поверхностного слоя. В присутствии антител сигнал закономерно снижался, а сульфаниламиды в наномолярном диапазоне концентраций регенерировали исходный сигнал в степени, определяющейся продолжительностью инкубирования и концентрацией в растворе. По сравнению с указанными биосенсорами разработанный ДНК-пероксидазный сенсор отличается более простым изготовлением, одностадийной процедурой измерения, отсутствием продолжительной стадии предварительного инкубирования и большим временем жизни. Кроме того, удалось почти в 50 раз снизить минимальную определяемую концентрацию сульфаметоксазола и в 5-15 раз - сульфатиазола. Обсуждены возможные причины расхождения результатов определения с помощью различных ДНК-пероксидазных сенсоров и сделаны рекомендации по подбору условий измерения сигнала при контроле сыворотки крови больных на активных стадиях лекарственной терапии.


Антрациклиновые препараты рубомицин и доксорубицин, обладающие свойствами интеркаляторов. Сигналы их окисления на стеклоуглеродных электродах проявляются при концентрации 1-200 мкМ. Модификация электродов 10 мкг см-2 ДНК снижает токи их окисления на 30-90% и смещает потенциал в сторону более анодных значений. Максимум изменения сигнала окисления препаратов соответствует тем же характеристикам состава поверхностного слоя, что и для ДНК-пероксидазного сенсора. Введение пероксидазы в состав биосенсора несколько снижает влияние интеркалирования рубомицина и доксорубицина на сигнал маркеров по сравнению с влиянием ДНК на чистом стеклоуглеродном электроде. Сигнал метиленового синего и метиленового зеленого в присутствии антрациклинов увеличивается за счет вытеснения интеркалированных форм маркеров и частичного экранирования отрицательного заряда фосфатного остова. При увеличении продолжительности инкубирования наблюдается некоторое ослабление влияния антрациклинов, что выражается в 25-30% изменении их исходного сигнала. Диапазон их определяемых концентраций практически совпадает с установленным для ДНК-сенсора в отсутствие пероксидазы и составляет 0.5-220 мкМ.


Цефтазидим и этидиум бромид. Данные препараты в микромолярном диапазоне концентраций снижали токи метиленового зеленого и несколько увеличивали токи метиленового синего, что связано с наложением процессов вытеснения интеркалированной формы маркеров и частичной десорбции метиленового синего. Аналогичным образом влияниет увеличение продолжительности контакта биосенсора с лекарственными препаратами: при инкубировании более 40 мин. влияние цефтазидима ослабляется, а сигнал в присутствии этидиума бромида стабилизируется на уровне 30-40% от его исходного значения.
Промазин и хлоропромазин. Окисление промазина и хлоропромазина на графитовом и золотом электродах осложнено необратимостью электрохимической реакции и образованием хемосорбированных продуктов, удаление которых с поверхности возможно только при механической зачистке электрода. При использовании стеклоуглеродных электродов, модифицированных полианилином, наблюдалось значительное увеличение абсолютной величины и чувствительности сигнала за счет снижения перенапряжения переноса электрона и влияния последующих химически стадий превращения первичных продуктов окисления. Иммобилизация на поверхности слоя полианилина ДНК приводит к дополнительному электростатическому концентрированию положительно заряженных молекул деполяризатора на отрицательно заряженных молекулах ДНК и как следствие - к увеличению токов их окисления. Введение в состав поверхностного слоя пероксидазы незначительно увеличило эффективность определения указанных препаратов, поскольку эффективность их пероксидазного окисления в целом существенно ниже, чем других фенотиазиновых соединений [J.Kulys, K.Krikstopaitis, A. Ziemys,JBIC 5 (2000) 333-340]. Разработаны способы их косвенного определения по влиянию на скорость прямого электронного переноса на активный центр фермента и ингибированию тока биокаталитического восстановления пероксида водорода в стационарных и проточно-инжекционных условиях. Присутствие ДНК в составе поверхностного слоя повышает чувствительность определения в силу дополнительного сорбционного концентрирования фенотиазиновых препаратов в непосредственной близости фермента. Разработаны методики определения промазина и хлоропромазина в лекарственных формах (капсулы, инъекционные растворы) и биологических жидкостях (урина, сыворотка крови) с пределом обнаружения 0.1 мкМ хлоропромазина и 0.07 мкМ промазина. Определение указанных соединений не требует присутствия дополнительных маркеров. Кроме того, предложено проводить определение промазина и хлоропромазина по их влиянию на сигнал метиленового синего, полученного с помощью ДНК-пероксидазного сенсора с биохимическими компонентами, иммобилизованными в белковой пленке. В отсутствие прямого электронного переноса на электроде реализуется двухсубстратный цикл, в котором происходит челночный перенос электрона в системе промазин - метиленовый синий - окисленная форма пероксидазы. Кинетический анализ показал отклонения от кинетики Михаэлиса-Ментен, связанные с неоднозначностью протекания восстановления окисленного гема фермента в присутствии двух медиаторов различной эффективности. Определены рабочие условия измерения сигнала, обеспечивающие максимальную чувствительность определения фенотиазиновых лекарственных препаратов. Показано, что в этих условиях чувствительность определения промазина и хлоропромазина увеличивается в 1.5 и 3 раза соответственно, а пределы обнаружения снижаются в 1.5 и 3 раза по сравнению с результатами определения в тех же условиях на стеклоуглеродном электроде, модифицированном только ДНК. Несмотря на то, что в данной методике требуется дополнительное введение маркера, она выгодно отличается от прямого безмедиаторного определения промазина и хлоропромазина в системе полианилин-ДНК-пероксидаза более высокой чувствительностью и воспроизводимостью сигнала, а также более продолжительным временем жизни биосенсора. Последнее определяется, вероятно, отсутствием продуктов хемосорбции и олигомеризации промазина.


Изучено влияние на сигнал ДНК-пероксидазного сенсора типичных представителей загрязняющих веществ сточных вод ряда химических производств. Установлено, что по характеру влияния их можно условно разделить на три группы. Полярные органические растворители (ацетон, спирты) снижают сигнал метиленового синего и метиленового зеленого в силу неспецифической инактивации пероксидазы в составе биосенсора. Относительное снижение сигнала имеет постоянный характер, с одним сенсором можно провести до 5-6 измерений 0.01-1 об.% растворителей, после чего требуется полная замена биохимических компонентов поверхностного слоя. Вторую группу составляют ароматические амины и спирты, относящиеся к органическим субстратам и эффекторам пероксидазы. Они способны активировать или ингибировать отклик ДНК-пероксидазного сенсора в зависимости от природы маркера и присутствия ДНК в поверхностном слое. Проведен скрининг широкого круга соединений и установлена возможность определения замещенных фенолов и производных анилина с алкильными, арильными заместителями, атомами хлора и аминогруппами в ароматической системе на уровне 0.1-10 мг/л. Особенностью влияния субстратов пероксидазы - потенциальных загрязнителей окружающей среды является пролонгированный характер действия (эффект закономерно увеличивается в течение 30-120 мин. контакта) и разнонаправленное влияние на сигнал метиленового синего и метиленового зеленого. Присутствие ДНК, как правило, повышает чувствительность определения субстратов пероксидаз, но увеличивает среднее время отклика до 10-15 мин. и снижает точность измерения сигнала (погрешность в серии 6 измерений с одним и тем же биосенсором до 30%). Напротив, действие тяжелых металлов - ингибиторов пероксидазы в присутствии ДНК резко снижается. Установлено достоверное влияние на сигнал ДНК-пероксидазного сенсора только ионов меди (более 1 мг/л) и ртути (0.1 мг/л). По-видимому, резкое снижение чувствительности активного центра фермента к металлам связано с их взаимодействием с
нуклеиновыми основаниями ДНК и белковой матрицей. В то же время, установлено синергирующее действие ионов меди в смесях с ароматическими аминами и гидразином. Установлено, что в присутствии 0.1 -10 мг/л ионов меди и постоянной концентрации органического компонента происходит увеличение сигнала биосенсора в области малых (до 1 мг/л) концентраций ионов металлов, составляющее до 300% относительно контрольно измерения. По-видимому, это связано с участием ионов меди (II) в генерировании гидроксидных радикалов, повреждающих ДНК и увеличивающих число центров связывания с маркерами. При большей концентрации ионов металла начинает превалировать их ингибирующее действие на индикаторный фермент, в результате чего сигнал ДНК-пероксидазного сенсора снижается. Установлено влияние денатурации ДНК на характер проявления сигнала субстратов пероксидазы и ионов металлов, а также изменение чувствительности отклика в зависимости от времени контакта и концентрации маркера. Установлено, что наиболее воспроизводимый и чувствительный сигнал достигается при концентрации метиленового синего и метиленового зеленого 60 мкМ и продолжительности инкубирования 10-20 мин. Третью группу составляют интеркаляторы - полиароматические соединения. В отличие от органических растворителей, их действие носит обратимый характер и проявляется только в узком диапазоне концентраций на уровне 0.1-10 нМ. Определена возможность применения ДНК-пероксидазного сенсора для группового определения указанных соединений в природных водах.


Помимо индивидуальных соединений – загрязнителей окружающей среды было изучено действие гидроксидных и супероксидных радикалов, генерируемых в системе пероксид водорода - железо (II) - аскорбиновая кислота (3). Генерирование гидроксидных и супероксидных радикалов проводили в нейтральной и слабощелочной среде, для повышения гидролитической устойчивости ионов Fe (II) в раствор добавляли ЭДТА. После инкубирования сигнал ДНК-пероксидазного сенсора в отношении метиленового синего и метиленового зеленого увеличивался в 2-4 раза за счет появления дефектов спирали ДНК и снижения эффективности интеркаляции маркера. Стационарное состояние достигалось после инкубирования в течение 6-12 минут. Лимитирующим фактором, определяющим повреждение ДНК, являлась концентрация пероксида водорода. Чтобы выделить участие аскорбиновой кислоты в реакции пероксидазного и неферментативного окисления в присутствии пероксида водорода, провели сравнение стационарных откликов ДНК-пероксидазного сенсора при его инкубировании в реактиве Фентона, содержащем и не содержащем аскорбиновую кислоту. До концентрации 0.1 мМ аскорбиновая кислота снижала действие ДНК-повреждающего фактора, что выражалось в относительном уменьшении сигнала маркера. При более высокой концентрации отношение токов увеличивалось, возможно, в результате ее участия в химическом восстановлении окисленной формы маркера. Напротив, рутин и глутатион в малых концентрациях, по-видимому, более эффективно реагируют с МС в растворе и лишь при более высоких концентрациях включаются в реакции с участием радикальных частиц. Предложено использовать реакцию Фентона для оценки общего уровня загрязнения объектов окружающей среды генотоксичными соединениями.

 

Степень новизны полученных результатов:
Полученные результаты обладают научной новизной. Впервые предложен и реализован новый способ регистрации слабых аффинных взаимодействий с участием нативной и денатурированной ДНК, основанный на параллельных реакциях пероксидазного окисления и интеркалирования фенотиазинового маркера. По сравнению с другими способами электрохимической регистрации сигнала ДНК-сенсоров, описанными в литературе, предложенный способ выгодно отличается более высокой чувствительностью в отношении соединений - интеркаляторов ДНК, более широким кругом определяемых соединений, включающим соединения, не относящиеся к субстратам и эффекторам пероксидазы и не обладающим электрохимической активностью. Впервые подробно рассмотрено различие в поведении нативной и денатурированной ДНК в реакциях с фенотиазиновыми маркерами, сульфаниламидами и загрязнителями окружающей среды. Впервые предложены способы определения сульфаниламидов в нано- и пикомолярном диапазоне их концентраций. Разработаны новые способы определения цефтазидима и фенотиазиновых лекарственных препаратов, ранее с использованием ДНК-сенсоров не изучавшихся. Предложены прямые (по скорости пероксидазного окисления) и косвенные (по влиянию на пероксидазное окисление метиленового синего и метиленового зеленого) способы определения промазина и хлоропромазина, отличающиеся высокой чувствительностью и простотой выполнения. Проведено широкое сравнительное изучение способов иммобилизации пероксидазы и ДНК, обеспечивающих необходимое сопряжение отдельных биохимических стадий, чувствительность и стабильность регистрируемого отклика биосенсора на соединения, по-разному реагирующие с пероксидазой и ДНК. В том числе, разработаны новые матрицы для иммобилизации биологических компонентов на основе тирамина и его сополимеров с замещенными фенолами. Изучено влияние ДНК, анионных компонентов (нафион) и условий полимеризации анилина на возможность достижения прямого электронного переноса на активный центр пероксидазы и использование этого процесса для определения веществ - медиаторов электронного переноса. Проведена полимеризация фенотиазиновых красителей и установлено различие в поведении образующихся полимеров и полианилина в пероксидазных реакциях окисления вторых субстратов. Впервые проведен скрининг потенциальных загрязнителей окружающей среды и определены соединения, влияющие на сигнал ДНК-пероксидазного сенсора по различному механизму действия. Впервые предложено использовать реакцию Фентона для стандартизации сигнала биосенсора на генотоксичные соединения и для характеристики антиоксидантного действия.


Сопоставление полученных результатов с мировым уровнем:
Электрохимические ДНК-сенсоры - одно из наиболее актуальных направлений развития современного электроанализа и биоаналитической химии в целом. Современные тенденции развития ДНК-сенсоров представлены в серии обзоров, опубликованных в крупнейших международных журналах [G.Marrazza, I.Chianella, M.Mascini, Anal.Chim.Acta. 387 (1999) 297-307; I.Pividori, A.Merkoci, S.Alegret, Biosens.Bioelectron. 15 (2000) 291-303; E.Palecek, Talanta 56 (2002) 809-819; V.C.Diculescu, A.-M.C.Paquim, A.M.Oliveira Brett, Sensors 5 (2005) 377-393]. Простота измерения сигнала, низкая стоимость базового измерительного оборудования, возможность проводить измерения в полевых условиях и в полуавтоматическом режиме выгодно отличают электрохимические сенсоры от более дорогих и громоздких флуоресцентных систем измерения. Они превосходят также пьезосенсорные методы по чувствительности регистрации низкомолекулярных соединений. В большинстве исследований электрохимически активные маркеры (ферроцены, производные гидрохинона, органические комплексы осмия, рутения, ряда других переходных металлов) используются без их включения в ферментативные реакции, часто при высоких анодных потенциалах, что затрудняет измерение сигнала в реальных образцах, содержащих электрохимически активные соединения. Основной целью создания ДНК-сенсоров остается диагностика генетического материала (установление присутствия комплементарных фрагментов по реакции их гибридизации с ДНК-зондами). Маркеры вносятся в состав олигонуклеотидов в качестве меток или интеркалируют в образующиеся двунитевые последовательности, теряя электрохимическую активность пропорционально концентрации мишени в растворе. Подобные подходы недостаточно чувствительны для обнаружения слабых взаимодействий с участием низкомолекулярных соединений, которые не меняют конформации ДНК или ее способности к гибридизации с ДНК-мишенью. Реализованный в рамках настоящего проекта новых подход к регистрации взаимодействий с ДНК с использованием ферментативной индикаторной реакции является важным расширением возможностей ДНК-сенсоров, что нашло отражение в приглашении участников коллектива с устными докладами на ряд международных конференций.

 

Методы и подходы, использованные в ходе выполнения проекта:
Использовали ДНК из эритроцитов цыпленка, очищенную от белка и переосажденную из фенола, и пероксидазу из хрена (Sigma), дополнительно не очищавшуюся. Электрохимические измерения проводили в режиме постояннотоковой и квадратноволновой вольтамперометрии в трехэлектродной ячейке с никелевым противоэлектродом и хлорсеребряным электродом сравнения. Измерения в потоке с ДНК-пероксидазным сенсором на основе электрода, модифицированного полианилином, проводили в разборной ячейке оригинальной конструкции, позволяющей регулировать объем рабочей камеры. Сигналом ДНК-пероксидазного и пероксидазного сенсора служили токи восстановления продуктов превращения вторых субстратов пероксидазы (маркеров), образующихся в присутствии пероксида водорода при внесении соответствующих соединений в раствор. В процессе эксперимента контролировали степень неферментативного окисления маркеров, скорость которой ограничивали, выбирая концентрацию пероксида водорода и продолжительность измерения. Разработана оригинальная методика получения планарных золотых электродов из записываемых компакт-дисков с золотым покрытием, с которых удаляли защитное покрытие. Также использовали золотые и стеклоуглеродные электроды фирмы BAS, эпоксиграфитовые и печатные графитовые электроды производства НПВП "ИВА" (Екатеринбург) и самостоятельно изготовленные стеклоуглеродные электроды СУ25000 с политетрафторэтиленовой изолирующей оболочкой. Для иммобилизации ДНК пероксидазы использовали физическую адсорбцию из растворов с последующей кросс-сшивкой глутаровым альдегидом, последовательность нанесения слоев и количество инертного белка (желатин, альбумин) определяли, исходя из времени жизни биосенсора, чувствительности сигнала фенотиазиновых маркеров и времени отклика. Кинетические параметры иммобилизованной пероксидазы определяли методом Хейнца. Способы получения покрытий из политирамина и его сополимеров, получаемые путем электрополимеризации, а также способы получения смешанных покрытий полианилин - нафион - ДНК, поли(фенотиазины) - ДНК разработаны в ходе выполнения настоящего проекта.