ГРАНТ РФФИ 00-03-32605

"Разработка электрохимических биосенсоров на основе планарных модифицированных электродов для диагностики загрязнения окружающей среды"

ИТОГОВЫЙ НАУЧНЫЙ ОТЧЕТ

За отчетный период были получены следующие основные результаты:
1. Разработаны новые способы изготовления электрохимических биосенсоров, сочетающие направленную модификацию поверхности преобразователя и иммобилизацию биологического компонента в сверхтонком слое, не создающем диффузионного торможения переноса субстрата и ингибитора из раствора в мембрану. На основе широкого скрининга потенциальных модификаторов установлены наиболее перспективные пути модификации, позволившие расширить круг определяемых соединений, повысить чувствительность определения субстратов и ингибиторов ферментов, а также уменьшить влияние матрицы. К числу новых модификаторов, ранее в составе биосенсоров не использовавшихся, относятся 1,3-дизамещенные калик[4]арены и их тиоаналоги, алкоксифенил  салицилальдимин метакрилаты. Их присутствие в растворе и на поверхности электродов приводит к улучшению аналитических и операционных характеристик холинэстеразных сенсоров. Повышается устойчивость и величина сигнала, снижается его дрейф при хранении и эксплуатации биосенсора. Присутствие органических кислот и аминокислот, а также ионов переходных металлов вызывает изменение сигнала биосенсора, обусловленное образованием комплексов "гость-хозяин". По результатам спектральных и кинетических исследований, в случае каликсаренов молекулы "гости", обладающие карбоксилатной группой, координируются вне полости каликсарена, располагаясь между заместителями нижнего обода. Такой комплекс, взаимодействуя с активным центром холинэстеразы, блокирует поступление субстрата благодаря гидрофобным взаимодействиям фенольных групп каликсарена и остатков триптофана, выстилающих поверхность белка вблизи активного центра. Изучена кинетика комплексообразования и влияние строения заместителя на эффективность связывания. При иммобилизации на поверхности электрода, в дополнение к данному механизму установлено сорбционное накопление продукта ферментативной реакции - тиохолина, окисляющегося на электроде. Обработка аминопроизводного каликсарена или салицилальдиминметакрилата, иммобилизованных на поверхности электрода, солями меди приводит к резкому увеличению тока окисления тиохолина и снижению рабочего потенциала биосенсора. Это связано с образованием тройных комплексов "хозяин" - ион меди (II) - тиохолин, повышающих поверхностную концентрацию деполяризатора и облегчающих его окисление на модифицированном электроде. Присутствие указанных модификаторов также снижает влияние матрицы при определении специфических субстратов и эффекторов холинэстераз. Разработаны амперометрический и потенциометрический варианты биосенсора на основе электродов, модифицированных каликс[4]аренами с индофенилацетатом и ацетилтиохолином в качестве  субстрата холинэстеразы. Впервые предложено использовать для определения ингибиторов фермента электроды, модифицированные полианилином, допированным камфорсульфоновой кислотой. По сравнению с электрохимически полимеризованным анилином, модификатор, продукт низкотемпературной окислительной полимеризации в присутствии персульфата аммония позволяет получить супернернстовский наклон рН-зависимости потенциала (до 90 мВ по сравнению с 40-50 мВ для электрохимически полимеризованного полианилина и 70 мВ для сополимера анилина и сульфаниловой кислоты). Это существенно повышает точность измерения малых сдвигов рН в ферментсодержащем слое , что важно при определении ингибиторов ферментов. Разработаны  холинэстеразные потенциометрические сенсоры на основе стеклоуглеродного и печатного графитового электродов, модифицированных допированным полианилином. Биосенсоры отличаются высокой чувствительностью определения  пестицидов антихолинэстеразного действия в сочетании с устойчивостью регистрируемого сигнала в анализируемых средах с переменной кислотностью и буферной емкостью. Биосенсоры были испытаны в контроле общего уровня загрязнения минерализованных сточных вод, а также остаточных количеств фосфорорганических пестицидов. Предложенное сочетание в конструкции одного и того же сенсора принципов молекулярного распознавания определяемого вещества и биохимической регистрации сигнала было реализовано также в создании сенсоров для регистрации слабых аффинных взаимодействий с участием ДНК. Субстратом служил метиленовый синий. Он конкурентно связывается с двунитевой ДНК и окисляется в в пероксидазной реакции. Оба биологических компонента были совместно иммобилизованы на поверхности  амперометрического преобразователя, регистрирующего активность пероксидазы. Вещества, взаимодействующие с  ДНК, вытесняют метиленовый синий из комплекса и увеличивают сигнал сенсора. ДНК-сенсор был испытан в определении антител к ДНК в крови больных системной красной волчанкой и бронхиальной астмой, а также в групповом определении ветеринарных препаратов сульфамидного ряда (сульфаметоксазол, сульфатиазол и др.), загрязняющих окружающую среду и продукты питания.

 

2. Разработаны новые методы модификации электродов с помощью полимеров, наносимых на поверхность из органических растворов или путем электрополимеризации. Так, предложено использовать нафион для стабилизации и иммобилизации холинэстеразы и пероксидазы на печатных графитовых электродах. Эффект достигается за счет электростатического взаимодействия полимера и белковой глобулы, а также за счет пассивного включения фермента в полимер с последующей кросс-сшивкой парами глутарового альдегида. В результате биосенсоры сохраняют высокий уровень ферментативной активности в течение 7-10 месяцев при хранении в сухом виде. Разработаны способы одновременного включения двух ферментов на один и тот же носитель. Разработанные биферментные сенсоры позволяют проводить измерение содержания субстратов пероксидаз и ингибиторов холинэстераз из одной пробы. Селективность сигнала достигается за счет выбора специфического субстрата фермента и рабочего потенциала измерения сигнала. Отклик биферментного сенсора отличается высокой стабильностью и не зависит от очередности измерения специфической ферментативной активности. Присутствие нафиона позволяет также снизить влияние матрицы и повысить селективность измерения сигнала. Так, в случае холинэстеразы нафион подавляет сопряженный процесс окисления иодида (противоион субстрата), мешающий прямому измерению холинэстеразной активности на металлических электродах. Снижается мешающее влияние обратимых эффекторов - ионов металлов и фторидов - при определении остаточных количеств фосфорорганических пестицидов в растительных и почвенных экстрактах. В результате при определении кумафоса, трихлорфона, хлорпирифос-метила, альдикарба, метиокарба наклон градуировочной зависимости увеличивается в 1.2- 1.5 раза, а предел обнаружения снижается в 1.5-2 раза по сравнению с немодифицированными биосенсорами. Разработаны способы получения смешанного полиэлектролитного покрытия на основе нафиона и положительно заряженных полимеров - полианилина и политирамина. Нафион увеличивает адгезию полимерного слоя к графитовому электроду и стабилизирует полимер в щелочной среде. В случае электропролимеризованного  полианилина присутствие нафиона позволяет проводить измерение сигнала холинэстеразного сенсора при рН 8.0 - 9.0. При электрополимеризации тирамина в присутствии нафиона увеличивается поверхностная концентрация  аминогрупп полимера и эффективность последующей пришивки ферментов - пероксидазы и холинэстеразы – путем кросс- сшивки глутаровым альдегидом.  Предложены способы электрополимеризации красителей феназинового ряда - метиленового синего, метиленового зеленого, Meldola's Blue, Nile Blue. Полученные покрытия сохраняют обратимость окислительно-восстановительных процессов, свойственную мономерам. Определены рабочие условия полимеризации и время жизни покрытий в различных условиях эксплуатации и в составе различных биосенсоров с иммобилизованной пероксидазой и тирозиназой. Биосенсоры на основе электродов, модифицированных медиаторами электронного переноса, были использованы в определении субстратов ферментов (эфиры холина и тиохолина, анилин и его производные, гидрохинон) в микромолярном диапазоне их концентраций в амперометрическом и потенциометрическом режимах регистрации сигнала. По сравнению с немодифицированными аналогами присутствие медиаторов позволило увеличить сигнал биосенсора и снизить потенциал его измерения, в том числе для прямого определении указанных соединений в пробах сложного состава без пробоподготовки.

 

3. Проведена развернутая характеристика разработанных биосенсоров в определении специфических субстратов и ингибиторов ферментов. Как было показано для холинэстеразных биосенсоров на основе печатных графитовых и стеклоуглеродных электродов, различающихся по источнику фермента, модификатору и способу регистрации аналитического сигнала (всего более 30 различных конструкций биосенсоров), основным фактором, определяющим чувствительность сигнала в отношении пестицидов антихолинэстеразного действия, является  массоперенос субстрата и ингибитора на границе мембрана - раствор. Инертный белок ферментного препарата и дополнительные покровные пленки альбумина тормозят вынос продуктов ферментативной реакции в раствор. Это повышает их приэлектродную концентрацию. В результате нивелируются различия в уровне ферментативной активности исходных препаратов фермента, использованных при иммобилизации: сигнал биосенсора примерно одинаков несмотря на 100-кратные различия в активности фермента. Повышение чувствительности регистрации малых изменений активности холинэстеразы после ее контакта с ингибитором снижает пределы обнаружения пестицидов и погрешность измерения сигнала биосенсора в средах  переменного состава. Помимо влияния инертного белка, скорость переноса ингибитора в ферментсодержащий слой зависит от гидрофильно-гидрофобного баланса на поверхности белкового слоя. Плохо растворимые в воде тионовые пестициды в процессе инкубирования накапливаются на мембране, что увеличивает их влияние на сигнал биосенсора по сравнению с нативным ферментом. Эффект особенно заметен при использовании относительно толстых (0.1 мм) мембран (малоактивные препараты бутирилхолинэстеразы) и слабо проявляется в поведении биосенсоров со сверхтонкими слоями высокоактивного препарата бутирил- или ацетилхолинэстеразы производства "Sigma", иммобилизованного в парах глутарового альдегида. Независимо от природы пестицида и способа регистрации сигнала биосенсора наклон градуировочной зависимости определения пестицида меняется в ряду: малоактивные препараты бутирилхолинэстеразы > высокоактивные препараты ацетилхолинэстеразы, покрытые пленкой альбумина > высокоактивные препараты фермента. Хорошо растворимый в воде хлорофос и карбаминатные пестициды ингибируют иммобилизованные ферменты на печатных графитовых электродах практически так же, как и нативные ферменты в тех же условиях. Для них пределы обнаружения и наклоны градуировочных зависимостей определяются прежде всего бимолекулярными константами ингибирования и зависят от природы ингибитора и источника фермента. Тем не менее, дополнительные покровные пленки альбумина несколько повышают степень ингибирования в области малых концентраций пестицидов при сохранении или некотором уменьшении наклона градуировочной зависимости в целом. Способ регистрации сигнала (потенциометрические и амперометрические сенсоры, в том числе на основе печатных графитовых электродов, модифицированных тетрацианохинодиметаном и берлинской лазурью) при одинаковых условиях иммобилизации фермента практически слабо влияет на аналитические характеристики определения пестицидов.  Пероксидазные биосенсоры позволяют проводить измерение содержания ароматических аминов как в одно-, так и в многокомпонентных растворах в микромолярном диапазоне их концентраций. При совместном присутствии нескольких аминов на градуировочных зависимостях наблюдаются острые максимумы при стехиометрических соотношениях концентраций субстратов. Синергический эффект может быть отнесен к образованию олигомерных продуктов окислительного сочетания, более реакционноспособных, чем исходные мономеры. Условия иммобилизации пероксидазы (физическая сорбция, включение в пленку нафиона, кросс- сшивка глутаровым альдегидом, пришивка к политираминовому слою на электроде) незначительно влияют на характеристики определения аминов, несколько меняя диапазон линейности и предел обнаружения субстратов при сохранении угла наклона градуировочной зависимости.

 

4. Разработанные холинэстеразные и пероксидазные сенсоры были испытаны в контроле реальных объектов окружающей среды, - растительных и почвенных экстрактов и промышленных сточных вод. Исследовано влияние матрицы объекта контроля на сигнал биосенсора и чувствительность определения модельных пестицидов, добавляемых к пробам. Для определения пестицидов в зерне, овощной продукции и почвенных экстрактах предложена упрощенная процедура пробоподготовки, включающая экстракцию пестицидов ацетонитрилом, окисление тионовых пестицидов в разбавленном экстракте в электролизе и определение ингибирующего действия экстракта после удаления избытка хлора. Как было показано, ацетонитрил в количестве до 15 об.% в отличие от других экстрагентов вызывает незначительную активацию холинэстеразы, как нативной, так и иммобилизованной на поверхности электрода. Активирующее действие ацетонитрила и ингибирующее действие пестицидов аддитивно складывается, что позволяет проводить количественную оценку содержания пестицидов без трудоемкой процедуры выпаривания экстракта. При оценке содержания пестицидов в виноградном соке наилучшие результаты были получены с биосенсором на основе печатного графитового электрода, модифицированного полианилином, а также биферментного сенсора с холинэстеразой и холиноксидазой, иммобилизованной на электроде, модифицированном берлинской лазурью. В последнем случае мерой холинэстеразной активности служил электрокаталитический ток восстановления пероксида водорода, образующегося в последовательности ферментативных реакций превращения субстрата – ацетилхолина. Определены условия измерения сигнала, полностью нивелирующие ингибирующее действие природных фенольных соединений, содержащихся в виноградном соке. Достигнутые пределы обнаружения позволяют определять содержание пестицидов антихолинэстеразного действия в соке на уровне норм, установленных в Европейском Сообществе (0.1 мг/кг). Холинэстеразные и пероксидазные сенсоры на основе печатных графитовых электродов были также использованы для групповой оценки загрязненности вод. При этом относительное снижение сигнала холинэстеразного сенсора коррелировало с суммарным содержанием ионов тяжелых и токсичных металлов, а сигнал пероксидазного сенсора – с суммарным содержанием легко окисляющихся органических соединений. Разбавление сточных вод в пропорции от 1:10 до 1:1000 нерегулярно меняет сигнал пероксидазного сенсора. Для всех испытанных образцов вод при их разбавлении наблюдался максимум сигнала, положение которого менялось симбатно с величиной БПК сточных вод. Применение дискриминантного анализа и нейросетевых методов дискриминации позволило разработать алгоритмы идентификации источника загрязнения вод по совокупности показателей пероксидазной и антихолинэстеразной активности вод. Классификация имеет характеристику, существенно превосходящую методы, опирающиеся на традиционные гидрохимические показатели качества вод. Установлены критерии обучения нейронных сетей и качества классификации для ряда типичных источников поступления токсикантов (на примере промышленных предприятий г.Казани). Всего было разработано более 10 методик группового и индивидуального определения загрязнителей окружающей среды (фосфорорганические и карбаминатные пестициды, фенолы, ароматические амины, ветеринарные препараты) и упрощенные способы пробоподготовки (экстракция ацетонитрилом, окисление тионовых пестицидов в электролиза) ориентированные на использование в отрыве от лабораторной базы. Предложена система проточно- инжекционного измерения остаточных количеств пестицидов, позволяющая проводить до 15 измерений в час в непрерывном режиме в течение рабочего дня.

Модификацию преобразователей и иммобилизацию ферментов проводили методом послойной иммобилизации, разработанной авторами ранее (грант РФФИ 97-03-33210). Он предполагает последовательное нанесение слоев, что позволяет исключить контакт несовместимых реагентов и инактивацию фермента. Технологии нанесения нафиона и смешанных полимерных покрытий, в том числе путем электрополимеризации на электродах с нафионом, модификации электродов алкоксифенил салицилальдимином, каликсаренами и каликсрезорциноларенами, полимеризации тирамина и феназиновых красителей разработаны в ходе выполнения проекта. Синтетический полианилин,  допированный камфорсульфоновой кислотой, предоставлен проф.Г.П.Карпачевой (Институт нефтехимического синтеза  им. А.В.Топчиева РАН). Изучение условий модификации графитовых электродов полианилином проводилось совместно с Лабораторией биосенсоров и биоэлектроники кафедры химической энзимологии МГУ. Измерение ферментативной активности нативных препаратов, определение кинетических параметров ингибирования проводили методом начальных скоростей с помощью оригинальной методики полумикроанализа с фотометрической регистраций сигнала. Амперометрические измерения проводили в хроноамперометрическом режиме с помощью анализаторов ИВА-3 и ИВА-5(ферментные сенсоры) и в режиме квадратноволновой вольтамперометрии с помощью анализатора BAS Inc. (США) CV-50W (ДНК-сенсоры). Программное обеспечение к анализаторам ИВА было  доработано с целью повышения точности измерения плохо разрешенных пиков (Иванов А.Н.).