РАЗВЕРНУТЫЙ НАУЧНЫЙ ОТЧЕТ

 Проект связан с решением фундаментальной проблемы селективности и чувствительности биосенсоров в отношении субстратов и ингибиторов ферментативной реакции. Основное     внимание при реализации проекта уделялось изучению влияния гетерогенных факторов(изменение субстрат-ингибиторной специфичности фермента в процессе его иммобилизации, влияние микроокружения фермента в мембране, торможение массопереноса      реагентов в мембране, сорбционные эффекты) на аналитические характеристики определения ингибиторов гидролитических ферментов с помощью электрохимических биосенсоров. Исследования включали следующие этапы: 

1). Изучение влияния способа иммобилизации фермента на отклик и ингибиторную специфичность биосенсора.  

2). Изучение влияния условий измерения и состава реакционной среды на аналитические характеристики определения  ингибиторов.

3). Изучение неферментативных факторов, обусловливающих  аналитические характеристики биосенсоров (способ детектирования, сорбционные эффекты). 

 За отчетный период получены следующие важнейшие результаты.

1) Предложен новый метод иммобилизации гидролитических ферментов на различных носителях и непосредственно на активной части сенсора. Метод состоит в последовательном нанесении на носитель стабилизированных препаратов фермента, медиаторов электронного переноса, модификаторов и т.д. с закреплением каждого слоя кросс-сшивкой глутаровым альдегидом, взятым в водном растворе или в парах (послойная иммобилизация). Полученные таким образом асимметричные мембраны отличаются повышенной чувствительностью к ингибиторам ферментов, а также улучшенными операционными характеристиками по сравнению с традиционными накладными мембранами. Так, использование покровных сверхтонких слоев альбумина повышает в 1.5-2.0 раза аналитический сигнал амперометрических биосенсоров при определении фосфорорганических пестицидов при сохранении наклона градуировочной зависимости (биосенсоры на основе сурьмяного рН-метрического и планарного эпоксидно-углеродного электрода) при сохранении или некотором увеличении наклона градуировочной зависимости. В ряде случаев использование модификаторов (каликсарены) позволило получить селективный отклик биосенсора к веществам, не являющимся ингибиторами ферментов, что расширяет перечень потенциальных загрязнителей окружающей среды, определяемых с помощью биосенсоров. Сигнал биосенсора обусловлен взаимодействием азоторганических соединений с каликсареном с образованием комплексов гость-хозяин. В результате такого взаимодействия ферментсодержащая мембрана приобретает положительный заряд. Это снижает скорость переноса положительно заряженных эфиров холина - субстратов холинэстераз - и вызывает снижение отклика биосенсора, формально соответствующее кинетике конкурентного ингибирования. Кроме того, модифицированные мембраны отличаются повышенной устойчивостью отклика (дрейф не более 2 мВ в сутки для потенциометрического детектирования).

2). Разработано свыше 20 различных конструкций электрохимических биосенсоров, отличающихся по природе носителя фермента, способу включения ферментсодержащей     мембраны, методу измерения отклика, а также упрощенные методики определения фосфорорганических пестицидов в объектах окружающей среды (воды, почвы, растительный материал) с использованием разработанных биосенсоров и ферментных тест-устройств. В составе биосенсоров использовали бутирилхолинэстеразу из сыворотки крови лошади, ацетилхолинэстеразу из эритроцитов крови человека (АО "Биомед", Пермь, "Serva"), микробиальную карбоксилэстеразу (АО "Биотехнология", Москва), иммобилизованные на нитратцеллюлозных ("Amersham", "Sartorius"), нейлоновых  ("Amersham"), бумажных мембранах, в желатине, тринитрате целлюлозы, альбумине. Биосенсоры позволяют детектировать присутствие фосфорорганических пестицидов в объектах окружающей среды на уровне 0.1-5 ПДК, причем изменение пределов обнаружения пестицидов при использовании одного и того же биосенсора симбатно изменению соответствующих значений ПДК независимо от материала мембраны: фозалон < диазинон < карбофос < метафос < хлорофос.

3). Оценка кинетических параметров ингибирования нативной и иммобилизованной на различных носителях холинэстеразы позволила выявить влияние процессов массопереноса     компонентов реакции на границе мембрана-раствор на чувствительность биосенсоров к ингибиторам различного механизма действия. При использовании гидрофобных носителей     (нитрат целлюлозы, нейлон) происходит сорбционное концентрирование гидрофобных фосфорорганических пестицидов, в результате чего снижаются пределы их обнаружения и  увеличиваются экспериментальные значения бимолекулярной константы ингибирования. Добавки неионогенных ПАВ (полиэтиленгликоли, Тритон-Х-100,Tween-20, Tween-80) нивелируют влияние носителя фермента на его чувствительность к действию необратимых ингибиторов. В наибольшей степени присутствие ПАВ проявляется при использовании в качестве носителя фермента гидрофильных материалов. В их присутствии происходит закономерное снижение в 2-8 раз предела обнаружения пестицидов и увеличение чувствительности их определения. Напротив, действие обратимых ингибиторов -      гидрофильных ионов (соли металлов, фториды) в присутствии ПАВ подавляется. Тем самым появляется возможность дифференцировать отклик биосенсора в многокомпонентных средах. 

4). Изучено влияние на отклик разработанных холинэстеразных биосенсоров макрокомпонентов, присутствующих в объектах окружающей среды. Показано, что в присутствии ионов тяжелых и токсичных металлов (рН 5.5-7.5) и фторид-ионов (рН 8.0)  чувствительность нативного фермента к пестицидам снижается в силу защитного эффекта. Защитное действие ионов металлов максимально в диапазоне рН, соответствующем накоплению  гидроксоформ металлов, обратимых ингибиторов фермента. Для иммобилизованного фермента защитный эффект проявляется в меньшей степени как за счет локальных сдвигов рН в мембране, так и за счет сорбционного накопления пестицида на гидрофобных носителях. Он проявляется в некотором снижении степени ингибирования холинэстеразы при сохранении угла наклона градуировочного графика пестицида. Добавки 0.001-0.1% ПАВ полностью подавляют защитное действие эффекторов  холинэстеразы и позволяют проводить определение пестицидов без их предварительной экстракции из анализируемой пробы. Гидразониевые соли диалкилдитиофосфатов и аминофосфонаты не проявляют ингибирующего действия на нативный и иммобилизованный фермента в силу взаимной координации аминогруппы и фосфорильного фрагмента молекулы. Электрохимическое окисление ингибиторов приводит к "активации" указанных соединений. Продукты окисления (гидроксифосфонаты или фосфаты)проявляют необратимое ингибирующее действие с максимумом при рН 3-4. Использование микробиальной карбоксилэстеразы, сохраняющей активность в данном диапазоне рН, позволило снизить пределы обнаружения указанных соединений до величины 0.1 мкмоль/л. Иммобилизация      холинэстеразы на бумаге повышает рН-оптимум ингибирования до рН 6.0-6.5 вследствие торможения выноса продуктов ферментативной реакции в раствор. Проведена оптимизация  условий определения соединений смешанного механизма  ингибирования с помощью нативного и иммобилизованного ферментов.  Присутствие полярных органических растворителей (ацетон, этанол, ацетонитрил) снижают активность нативной холинэстеразы в концентрации более 10-15%. Добавки полисахаридов производные хитозана, полиглюкин, декстран)  повышают устойчивость фермента. Это позволило проводить измерение фосфорорганических пестицидов непосредственно в разбавленных органических экстрактах с содержанием  растворителя до 30%, без его предварительного упаривания. Иммобилизация холинэстеразы на бумаге также повышает ее устойчивость в водно-органических средах: аналитические характеристики определения пестицидов не зависят от присутствия указанных растворителей в концентрации до 20%.

5). Изучено влияние способа детектирования ферментативной реакции на аналитические характеристики определения ингибиторов различного механизма действия. При использовании накладных ферментсодержащих мембран на желатиновой или нейлоновой основе градуировочные кривые определения пестицидов практически совпадают. В области низких концентраций ингибитора некоторое преимущество имеют потенциометрические биосенсоры, возможно, из-за возмущающего действия фарадеевских процессов, меняющих рН в приэлектродной области. Разработаны новые способы амперометрического детектирования холинэстеразной активности, основанные на использовании новых субстратов   (дихлориндофенилацетат, п-аминофенилацетат, система бутирилтиохолин - серебро), а также новых электродных  материалов. Предложены новые планарные и объемные угольно-пастовые электроды на основе эпоксидной композиции, обладающие низкой величиной фонового тока, полируемые и устойчивые к щелочной деградации. На их основе предложены конструкции проточных холинэстеразных биосенсоров, позволяющие проводить 20-30 измерений в час в течение нескольких суток без механического обновления поверхности. Показано, что в проточно-инжекционном режиме происходит дополнительное накопление гидрофобных пестицидов благодаря высокому соотношению площади поверхности мембраны к объему   проточной ячейки. В результате снижаются пределы обнаружения пестицидов (с 5 нмоль/л для нативного фермента до 4 и 1.5 нмоль/л для холинэстеразы, иммобилизованной на нейлоне и нитрате целлюлозы соответственно. Напротив, при определении обратимых ингибиторов в потоке результирующее снижение сигнала определяется соотношением концентрации субстрата и гидрофильных фторид-ионов, которое при использовании тех же носителей ниже, чем в стационарных условиях. Другие параметры (объем петли, скорость потока, концентрация буферного раствора в диапазоне 0.01-0.0001 моль/л) практически не влияют на ингибирующее действие фторидов и пестицидов. Аналогичные результаты были получены на планарных электродах производства НПВП "ИВА" (Екатеринбург). Сравнение аналитических характеристик амперометрических и потенциометрических биосенсоров на основе накладных мембран и фермента, иммобилизованного непосредственно на поверхности, показало, что независимо от способа детектирования биосенсоры с накладными мембранами демонстрируют меньшую погрешность измерения отклика и большее время отклика, что связано с различным диффузионным торможением переноса субстрата и продукта ферментативной реакции между раствором и мембраной. Чувствительность определения пестицидов меняется незначительно. По сравнению с использованием накладных мембран, биосенсор на основе сурьмяного или угольно-пастового электродов с холинэстеразой, иммобилизованной на поверхности, демонстрирует более узкий диапазон определяемых концентраций ингибиторов. Снижается верхняя граница определяемых концентраций фосфорорганических пестицидов, причем градуировочный график выходит на предел, соответствующий степени ингибирования 60-70%. Разработаны методы получения сверхтонких ферментсодержащих слоев, основанные на использовании высокоактивных препаратов фермента (более 600 Е/мг) с кросс-сшивкой парами глутарового альдегида. Подобные биосенсоры демонстрируют высокую воспроизводимость отклика (2-3%) и практически те же аналитические характеристики определения пестицидов, что и нативный фермент в силу отсутствия диффузионных ограничений реагирования, однако время жизни иммобилизованного фермента составляет всего несколько дней по сравнению с несколькими месяцами для бумажных мембран. Кроме того, подобные биосенсоры теряют отклик даже при кратковременном высушивании.

6). Развиты новые подходы к обобщенной оценке загрязнения  реальных объектов окружающей среды (промышленные и сточных воды, экстракты из почв, осадков сточных вод, растительного материала) с использованием показателей антихолинэстеразной активности и современных методов математической обработки информации. На основании предварительного скрининга образцов сточных вод промышленных и муниципальных предприятий г.Казани и приказанского региона предложена экспертная система оценки характера загрязнения, включающая показатели биохимического и химического потребления кислорода, смертности инфузорий в часовой экспозиции и снижения отклика холинэстеразного биосенсора до и после электрохимической обработки пробы. Процедура электрохимической обработки позволяет учитывать вклад неустойчивых загрязнителей, не оказывающих значительного влияния на долгосрочные последствия загрязнения. В результате классификации все исследованные воды были разделены на три класса в соответствии с токсическим эффектом загрязнителей:  а) воды, загрязненные преимущественно токсичными металлами; б) воды, загрязненные устойчивыми органическими соединениями; в) воды, загрязненные неустойчивыми, легко распадающимися органическими соединениями. Для классификации использовались дискриминантный анализ и нейросетевые методы на основе сетей прямого распространения и теории адаптивного резонанса (Fuzzy ART Map). Проведена оптимизация строения нейронных сетей и процедуры обучения. Показано, что дискриминантный анализ позволяет эффективно выделять только сточные воды, загрязненные тяжелыми и токсичными металлами (успешный прогноз класса вод в 50-60% случаев). Нейросетевые методы при проведении процедуры обучения на всей выборке позволяют добиться правильного предсказания класса сточных вод в 70-80% случаев, а при выделении контрольной выборки (25 элементов, не используемых в процедуре обучения) – в 60-75% случаев. Результаты обучения определяются последовательностью подачи элементов на обучение, способом генерирования контрольной выборки и задаваемым параметрам обучения (скорость обучения и  вигиланс). Поскольку разделение органического загрязнения на два класса носит условный характер и неоднозначно, проведена также классификация выборки на два класса (загрязнение  неорганическими и органическими токсикантами). И в этом случае наибольшую вероятность успешного прогноза показали нейросетевые методы. Проведена также экспертная оценка   загрязненности осадков сточных вод тяжелыми и токсичными металлами. В качестве независимых переменных использовали показатели ингибирования холинэстеразы различными экстрактами из осадков (водного, солевого, кислотного и ацетонового), а также показатели смертности инфузорий. Особенность данного объекта исследования состоит в том, что ингибирующее действие подвижных форм тяжелых металлов на холинэстеразу опосредовано процессами ионного обмена с поглощающим комплексом. Взаимодействие органического  вещества осадка с экстрагентом и солями приводит к высвобождению природных эффекторов холинэстеразы (соли кальция) и смещению рН в микроокружении фермента. В результате для нативного фермента наблюдается некоторое ускорение ферментативной реакции (до 30%). Связывание ионов тяжелых металлов в комплексы с органическими кислотами полностью подавляет их обратимое ингибирующее действие, даже при внесении дополнительных количеств солей металлов при компостировании. Для иммобилизованной холинэстеразы наблюдается снижение отклика на 10-50% за счет сорбции органических компонентов экстракта на мембране. Соотношение показателей ингибирования/активации холинэстеразы при действии различных экстрактов позволило предложить шкалу относительной загрязненности осадков сточных вод подвижными формами металлов, хорошо согласующуюся с результатами экспериментов по биотестированию. Исследована возможность использования применения биосенсоров на основе холинэстеразы, иммобилизованной на бумаге, для оценки загрязненности неоднородных сред, содержащих микроэмульсии и твердые взвешенные частицы. Показано, что в эмульсиях  наблюдается закономерное снижение отклика биосенсора, симбатное содержанию органической фазы, однако погрешность измерения аналитического сигнала (более 20%) позволяет  использовать биосенсор лишь для качественной характеристики эмульсий. Кроме того, для неустойчивых эмульсий часто наблюдался эффект полного подавления сигнала при    формировании компактного слоя органического растворителя (декан, хлороформ,тетрагидрофуран), контактировавшего, даже непродолжительное время, с ферментсодержащей мембраной. При включении в органическую фазу фосфорорганических пестицидов снижение отклика биосенсора представляло собой аддитивное сложение вкладов, относящихся к влиянию необратимого ингибитора и растворителя. При наличии в растворе взвешенных частиц из-за абразивного фермента отклик биосенсора даже в отсутствии специфических ингибиторов холинэстеразы менялся нерегулярным образом.

В рамках проекта впервые на основании комплексного изучения  поведения электрохимических холинэстеразных биосенсоров и стабилизированных препаратов фермента установлена роль гетерогенных факторов, определяющих вариации аналитических характеристик определения обратимых и необратимых ингибиторов в стационарных и проточных условиях. Показано, что аналитические характеристики определения специфических ингибиторов холинэстеразы, иммобилизованной на различных носителях, определяются помимо субстратно-ингибиторной специфичности фермента процессами массопереноса на границе мембрана-раствор. Изменение гидрофильно-гидрофобного баланса путем варьирования материала мембраны, введения в раствор поверхностно-активных веществ, полярных органических растворителей позволяет направленно менять чувствительность и селективность отклика биосенсора в отношении ингибиторов различного механизма действия, в том числе при их совместном присутствии в растворе. Аналогичным образом действует сорбционное накопление фосфорорганических пестицидов на гидрофобных мембранах при проведении инкубирования в нестационарных условиях в проточной ячейке. Разработаны новые амперометрические биосенсоры, в том числе базирующиеся на эпоксидно-графитовых электродах и синтетических субстратах. Впервые предложено использовать пакеты составных мембран для изучения распределения ингибитора в мембране. Установлены критерии кинетического режима функционирования биосенсора и на этой основе предложен метод выделения сорбционной составляющей ингибирования и расчета   бимолекулярных констант ингибирования холинэстеразы по результатам, полученным с помощью потенциометрических биосенсоров. Впервые для иммобилизованного фермента     проведено широкое исследование защитного эффекта обратимых ингибиторов холинэстеразы (ионы металлов, фториды). 

Показано, что в отличие от нативного фермента, защитное действие эффекторов опосредовано ионными равновесиями гидролиза и сдвига рН в ферментсодержащей мембране. Предложены упрощенные методики прямого определения остаточных количеств пестицидов в объектах окружающей среды без их концентрирования и удаления органического растворителя, а также методы оценки содержания подвижных форм металлов в осадках сточных вод. Впервые проведена сравнительная характеристика чувствительности разработанных холинэстеразных биосенсоров и методов биотестирования к приоритетным загрязнителям окружающей среды и на этой основе предложена система оценки загрязненности (токсичности) сточных вод и осадков сточных вод по характеру и возможному источнику загрязнения, базирующаяся на обобщенных гидрохимических, биологических показателях качества и антихолинэстеразной активности вод. По результатам скрининга реальных образцов промышленных сточных вод г.Казани и приказанского региона проведена классификация вод по преобладающему характеру загрязнения с вероятностью успешного прогноза класса вод до 80%. Произведена оптимизация структуры нейронных сетей и процедуры обучения, а также дана сравнительная характеристика традиционных (дискриминантный анализ) и нейросетевых методов математической классификации. Результаты исследований вошли составной частью в кандидатскую (Ризаева Е.П.) и докторскую (Евтюгин Г.А.) диссертации, защищенные в период выполнения проекта.